[发明专利]一种大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及动物病毒，更具体涉及生产动物用狂犬病毒抗原的方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)感染引起的一种病症严重、病死率极高的自然疫源性人兽共患传染病，死亡率几乎100％，目前尚无有效的治疗措施。野生动物是RV的主要储存宿主，人一旦被携带狂犬病毒的此类动物咬伤，就会感染发病，其病死率为100％。根据卫生部最新公布的传染病疫情统计数据，显示近年来狂犬病继续呈现凶险的迹象。但是狂犬病没有特殊有效的治疗手段，注射狂犬病疫苗是唯一有效手段。

目前市场上的狂犬病毒疫苗基本都是采用转瓶工艺传代细胞培养的，大规模生产需要大量的物力人力资源，成本较高，并且批间差异大，质量不稳定。

高效的疫苗生产需要大量的以高产量从宿主系统中生产出病毒。病毒株生长的培养条件对于获得该株系的可接受的高产量来说具有重大意义。因此，为了最大化所想要的病毒的产量，系统和培养条件都必须特定地适合于提供对于产生所想要的病毒来说有利的环境。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有工艺存在的不足之处，提供一种潮汐式细胞微载体悬浮培养系统大规模生产动物用狂犬病毒抗原的方法。该方法生产工艺简单且稳定、易操作，病毒抗原产量高，批间差异小，质量易控制，可显著提高疫苗产量和质量，降低成本。

为达到上述目的，本发明利用生物反应器，以细胞微载体悬浮培养系统生产动物用狂犬病毒抗原，包括下列技术步骤：

(1)培养制备抗原用细胞：

将制备抗原用宿主细胞接种到含有培养液与微载体的载体罐中，并将上述细胞与微载体混合均匀，启动贴附程序，使细胞贴附在微载体上；切换细胞培养程序，在适当培养环境下，提供上述细胞足够的养分和适宜的气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍。

(2)毒液的接种与繁殖：

将狂犬病毒制成病毒悬液，使其吸附到上述细胞上；换用细胞维持培养液，在适当培养环境下培养病毒；连续培养3～5日后，第一次收获病毒液，采用半连续工艺，换液比例为50％；继续培养9～11日，每24h收获换液一次，换液比例为50％。

(3)经检验合格后，将半连续工艺收获的病毒液与生物反应器的病毒液混合，于-20℃冻融两次，灭活纯化得到狂犬病毒抗原。

病毒液检验：按《中华人民共和国兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，完全符合，安全无副作用，无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。通过小鼠脑内接种法测定，病毒液每1.0ml病毒含量≥10^7.0LD₅₀；

上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖狂犬病毒的细胞系，如仓鼠肾细胞细胞系(BHK21)等。

本发明方法中所述的培养液最好是95％～98％DMEM，加2％～5％牛血清，加适量抗菌素，pH值为7.0～7.4较好。

上述技术方案中，所述接种的狂犬病毒可以是LEP-Flury毒株。

上述技术方案中，所述的适宜本发明的微载体可以为具有网状结构的纤维，如聚酯纤维等。

本发明方法中细胞获得气体交换的方式可以通过培养液液面升降的方式实现。

上述技术方案中，步骤(1)中，一般启动贴附程序后4h换成细胞培养程序。所述细胞贴附程序最佳参数为：up：2400mL/min hold 1min、Down：2400mL/min hold 1min、设定最大换液量18500mL；细胞培养程序最佳参数为：up：1800mL/min hold 1min、Down 1800mL/min hold 1min、设定最大换液量18500mL。

上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为每500ml培养液添加5.5g微载体较好，细胞的初始接种量为1.8～3.6×10⁷cells/g微载体较好。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度一般为1.1×10⁸～1.0×10⁹cells/g微载体。

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.O.I.)为0.01～1的比例。