[发明专利]用于高通量核酸分析的珠子

说明书

技术领域

本发明涉及核酸分析领域，具体来说是小型化的、高度平行的核酸序列检测以及核酸序列差异分析。

本发明基于如下想法：提供固体支持物，其结合有序列特异性引物，所述引物的一种是可裂解的，另一种是不可裂解的，从而分析特定序列或检测SNP、突变或任何所关注的特定DNA或RNA物质的存在。

背景技术

最近，公开了一种基于焦磷酸盐测序的超高通量的测序系统，该系统使得能够基本上在不大于一周的时间对细菌基因组进行测序(WO 04/70007；WO 05/03375；Margulies，M.，等人，Nature 437(2005)376-80)。由剪切的基因组DNA开始，单分子片段结合至珠子，该珠子被捕获在油中的PCR反应混合物乳液中。然后，扩增得到克隆扩增的DNA的文库，其中各珠子携带多拷贝的相同片段。

在乳液破乳(breakage of the emulsion)和PCR产物变性成单链之后，将珠子沉积在光纤皮可滴定板(picotiter plate)的多个孔内，使得一个孔中携带不大于一个的珠子。然后，在通过合成反应进行的测序中，进行引物延伸反应，其中在一连串的反复事件中提供4种不同的A、G、C和T三磷酸核苷或它们各自的类似物，新生链的序列由通过DNA聚合酶催化的延伸反应所衍生的化学产物来推断。具体而言，通过合成反应进行的测序是焦磷酸盐测序反应，其特征在于如下检测焦磷酸盐的生成：

PPi+腺苷5’磷酸硫酸酯(phosphosulfate)(APS)→ATP，在腺苷三磷酸双磷酸酶(Apyrase)的存在下催化

ATP+萤光素→光+氧化萤光素，在萤光素酶存在下催化检测氧化萤光素的发光

使用WO 04/70007和WO 05/03375中所公开的超高通量测序系统，可以同时进行大于1 000 000个的焦磷酸盐测序反应。焦磷酸盐的产生触发发光反应级联，最后用CCD相机检测光。

关于此技术，WO 04/69849公开了一种在单个反应管中以快速和经济的方式扩增多种核酸的方法(例如，DNA文库、转录组、基因组的各序列)。更具体地，WO 04/69849公开了在一个反应容器中同时进行多个样品(多至几十万)的克隆扩增(例如，通过PCR)。在这方面，WO 04/69849提供了如下的方法：将多个DNA样品各自封装在乳液微胶囊(即，微反应器)中，同时进行多个封装的核酸样品的扩增，从微胶囊释放所述扩增的多种DNA以用于随后的反应。例如，使单拷贝的(各)核酸模板物质杂交到捕获珠子上，所述珠子包含：例如，与核酸模板结合的化学基团或捕获寡核苷酸。将珠子悬浮在完全扩增溶液中，进行乳化以产生微反应器(直径通常为100至200微米)。此后，利用扩增(例如，PCR)来克隆增加微反应器中初始模板物质的拷贝数，这些拷贝结合在微反应器中的捕获珠子上。或者，将捕获珠子添加到包含核酸模板的扩增反应混合物中，将此混合物乳化以产生微反应器。利用扩增(例如，PCR)来克隆增加微反应器中初始模板物质的拷贝数，这些拷贝结合在微反应器中的捕获珠子上。因此，根据WO 05/03375的微反应器使得能够同时克隆和离散扩增许多不同模板而不会交叉污染扩增的产品或试剂或使一种特定的模板或模板组占主导(例如PCR偏向)。

然而，根据WO 05/03375，需要进行衔接子连接步骤，其中用衔接子序列标记多种不同的核酸分子，该衔接子序列随后可与具有共价连接的互补衔接子序列的珠子结合。

另一重要的DNA分析技术是分析型聚合酶链式反应(PCR)。然而，目前的PCR定量是基于类似(analogous)测量模式。但是在一些情况下，在诸如下列领域非常需要数字计数原理：

-癌症检测：在过量的野生型背景中进行的突变体等位基因定量

-等位基因失衡检测

-稀有转录本和/或转录本中突变体等位基因的基因表达

-病毒检测和定量

因此，DNA/cDNA/mRNA的数字计数的可用性解决了分子医药中未解决的需求，例如，癌症诊断的高度相关性、循环肿瘤细胞、出生前胚细胞，其中具体事件需要在高背景中检测。

因此，本发明的一个目的是提供同时分析多种核酸分子的改良方法和改良试剂。

在具体方面，本发明的目的是提供一种固体支持物或多种固体支持物，其可用于改善上述测序流程或能够进行数字PCR计数。