[发明专利]一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法

权利要求书

1.一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

(1)花蕾的选取和小孢子的分离

选取处于单核靠边期的花蕾，将其消毒处理后在分离培养基中进行无菌破碎，离心分离后获得小孢子，所述分离培养基为含蔗糖浓度为140-170mg/L的B5液体培养基；

(2)诱导加倍成胚培养

对分离后的小孢子进行诱导加倍培养，首先在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导，30-35℃的温度下暗培养24-72小时，所述启动培养基为含有0.5-100ppm秋水仙素加倍剂且蔗糖浓度为150-180g/L的NLN液体培养基；将小孢子膨大率达70％的样品离心，弃上清液后添加成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为5×10⁴-5×10⁵个/mL，然后进行成胚诱导暗培养，培养温度为22-25℃，所述成胚诱导培养基为含有0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸且蔗糖浓度为130-150g/L的NLN液体培养基；

(3)分化成苗与继代培养

A、分化成苗阶段：待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为20-28℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1-3周，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，所述的分化培养基为含0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸，9-15g/L琼脂的B5固体培养基；B、继代培养阶段：待成正常试管苗后，再转接至继代培养基上进行继代壮苗培养，所述的继代培养基为含0.01-0.5ppm多效唑的B5固体培养基；分化成苗和继代培养两阶段的培养条件为：温度22-25℃，光周期12-20h/d，光照强度1500-4000LUX；

(4)壮苗生根培养

待胚状体分化出茎叶，并成壮苗后，将其移至生根培养基上进行壮苗生根培养，直至苗壮根粗后移栽大田，所述生根培养基为含0.01-0.5ppm多效唑、0.01-0.5ppmα-萘乙酸的MS固体培养基。

2.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，步骤(1)中所述花蕾大小为3.5-5.5mm。

3.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，所述成胚诱导培养基中含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。

4.根据权利要求1所述的高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，其特征在于，所述分化培养基中含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。