[发明专利]一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物的双单倍体(DH)诱导方法，特别是涉及园艺作物结球甘蓝小孢子植株再生及其双单倍体的高效诱导方法及其和培养基。

背景技术

结球甘蓝是一种栽培面积大，适应性广、营养价值高，深受人民喜爱的食用蔬菜，但由于原产于地中海沿岸，国内种质资源匮乏，而国外表现优势的品种及亲本资源又难以获得，一直制约着我国甘蓝优良品种选育工作的开展，若通过双单倍体育种则必然为优良种质资源的获得和新品种培育创建了一种新的有效途径，也必然会大大提高育种选择效率，缩小育种群体规模，缩短育种年限。同时，利用双单倍体培养的变异能够创造许多抗病、耐盐、抗旱、抗虫等优良种质资源；该技术又可以和转基因技术、分子标记技术相结合，能有效推进相关研究和分子育种技术，具有广阔的应用前景。

但我国的结球甘蓝小孢子培养技术尚不够成熟，大多处在对近缘种培养技术的消化吸收及其有限改进上，效果欠佳，要么受基因型的限制，常不能出胚，或出胚量很少；要么成胚成苗过程易玻璃化，苗小根弱，移栽成活率低，远远不能满足大规模产胚并高效育种的要求。

发明内容

本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法。该方法涉及园艺作物结球甘蓝的小孢子植株再生及其双单倍体的诱导技术改进。

一种高效诱导结球甘蓝双单倍体的方法，采用的技术方案和具体操作步骤如下：

(1)花蕾的选取和小孢子的分离

选取处于单核靠边期的花蕾，将其消毒处理后在分离培养基中进行无菌破碎，离心分离后获得小孢子，所述分离培养基为含蔗糖浓度为140-170mg/L的B5液体培养基；

(2)诱导加倍成胚培养

对分离后的小孢子进行诱导加倍培养，首先在启动培养基中同步进行启动培养和加倍诱导，30-35℃的温度下暗培养24-72小时，所述启动培养基为含有0.5-100ppm秋水仙素加倍剂且蔗糖浓度为150-180g/L的NLN液体培养基；将小孢子膨大率达70％的样品离心，弃上清液后添加成胚诱导培养基悬浮，其中，小孢子的悬浮密度为5×10⁴-5×10⁵个/mL，然后进行成胚诱导暗培养，培养温度为22-25℃，所述成胚诱导培养基为含有0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸且蔗糖浓度为130-150g/L的NLN液体培养基；

(3)分化成苗与继代培养

A、分化成苗阶段：待胚状体至肉眼可见后将其转到温度为20-28℃、转速为60rpm的摇床上旋转培养1-3周，然后将胚状体接种于分化培养基上进行分化成苗，所述的分化培养基为含0.01-1ppm的6-苄氨基嘌呤和/或0.01-0.5ppm的α-萘乙酸，9-15g/L琼脂的B5固体培养基；B、继代培养阶段：待成正常试管苗后，再转接至继代培养基上进行继代壮苗培养，所述的继代培养基为含0.01-0.5ppm多效唑的B5固体培养基；分化成苗和继代培养两阶段的培养条件为：温度22-25℃，光周期12-20h/d，光照强度1500-4000LUX；

(4)壮苗生根培养

待胚状体分化出茎叶，并成壮苗后，将其移至生根培养基上进行壮苗生根培养，直至苗壮根粗后移栽大田，所述生根培养基为含0.01-0.5ppm多效唑、0.01-0.5ppm α-萘乙酸的MS固体培养基。

步骤(1)中所述花蕾大小为3.5-5.5mm，且小孢子发育时期在单核靠边期的比例达70％以上。

所述成胚诱导培养基中优选含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。

所述分化培养基中优选含有0.1-0.2ppm的6-苄氨基嘌呤和0.01-0.02ppm的α-萘乙酸。

本方法适用于多种基因型，如Q2、Q4、Q5、Q8、HP63和HW06，效果均较好。