[发明专利]一种猪诱导性多能干细胞诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞诱导领域，具体是一种猪诱导性多能干细胞诱导方法。

背景技术

多年来，人们一直在研究细胞的重编程及细胞核的潜在全能性，1998年多利羊的诞生标志着已将这一研究工作推进到哺乳动物领域。2006年，日本京都大学的Yamanaka教授在《Cell》上发表了具有里程碑意义的文章(Takahashi K和Yamanaka S，2006)，详细介绍了其利用四种限定因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将小鼠成纤维细胞重编程逆转为类似于多能性干细胞的研究工作及结果，从此开创了诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)时代。由于多能性干细胞(pluripotent stem cells)具有形成人和动物个体内所有类型细胞的多向分化潜能和不断自我更新的特性，使其在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学研究、药理及毒理学等领域的研究中有着其独特的作用和优越性，也正是由于诱导性多能干技术研究同时具备如此深远的科学价值和广泛的应用价值，其已成为当今生物学研究的热点之一，并在2007年分别被Nature、Science评为第一及第二大科学进展，又在2008年荣登Science十大科技进展榜首。在国内，中国科学院动物研究所周琪研究组和上海交通大学医学院曾凡一研究组合作诱导产生的小鼠诱导性多能干细胞通过四倍体胚胎互补技术获得了完全由诱导性多能干细胞制备的活体小鼠，有力地证明了诱导性多能干细胞具有真正的全能性(Zhao XY et al.，2009)。周琪等将诱导性多能干细胞研究推进到了一个新的高度，成为中国科学家在这一国际热点研究领域所作出的一项重要贡献。这一合作研究成果“诱导性多能干细胞的全能性被首次证明”成功入选2009年中国十大科技进展新闻和世界十大科技进展新闻。

与小鼠、大鼠、猴子等动物来源的胚胎不同，从猪胚胎分离出的细胞系在培养过程中很不稳定，很快就会失去其特性。尽管各国科学家已有多年的尝试，但目前尚未有成功分离猪的多能性胚胎干细胞系的报道。因此如果通过限定因子成功诱导产生具有全能性的猪诱导性多能干细胞，那么就能够有效地利用其干细胞特征进行相关的科学研究。例如，借助猪和人有许多生理同源性，利用猪源的多能性干细胞系可再现人类重大疾病(如心血管系统疾病)的发生发展过程、开发相应的大动物模型，用于针对该重大疾病的药物研发以及病因发病机制的研究。同时，中国是猪肉产品最大的生产和消费国，猪源的诱导性多能干细胞同样有可能用于提高猪肉质量以及与干细胞相关的饲养方式。

目前，世界上关于猪诱导性多能干细胞技术的研究仅有3篇文献报道，最早是在中科院广州生物医药与健康研究院裴端卿博士领导的研究小组获得了成功。他们利用逆转录病毒载体介导人或小鼠4种限定因子基因(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)成功将西藏小型猪的成纤维细胞诱导成西藏猪的诱导性多能干细胞，其形态类似于人类或猴类的胚胎干细胞。该研究结果在线发表于2009年4月21日的《The Journal of Biological Chemistry》杂志上(Esteban MA et al.，2009)。随后，中科院上海生物化学与细胞生物学研究所肖磊博士领导的研究小组和美国哥伦比亚州密苏里大学R.Michael Roberts领导的研究小组也相继利用慢病毒载体介导人或小鼠4种限定因子成功诱导产生了猪诱导性多能干细胞。但上述三个研究小组均未用组建限定因子融合蛋白来进行猪诱导性多能干细胞的诱导。

发明内容

本发明提供了一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，利用外源限定因子与增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein，EGFP)构建融合蛋白慢病毒表达载体用于猪诱导性多能干细胞的诱导，对表达外源限定因子融合蛋白的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代，逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆，细胞集落生长状态稳定，核型正常，碱性磷酸酶检测为阳性，免疫细胞化学检测显示Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性，体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤，结果证实分离培养的细胞克隆具有胚胎干细胞样特征，成功分离培养得到猪诱导性多能干细胞。

本发明的技术方案为：

2、一种猪诱导性多能干细胞诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、限定因子慢病毒表达载体的构建：

根据猪Sox2、c-Myc、Klf4基因的mRNA序列和人Oct4的DNA序列，设计合成出pSox2、pKlf4、pc-Myc、hOct4基因的上、下游引物；