[发明专利]一种卤虫卵中海藻糖含量的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种海藻糖含量的检测方法，特别是一种卤虫卵中海藻糖含量的检测方法， 属于生物化学技术领域。

背景技术

卤虫(Artemia)属于甲壳动物亚门(Crustacea)鳃足纲(Branchiopoda)无甲目 (Anostraca)卤虫科(Artemidae)，是具有重要经济意义的水生甲壳动物，几乎分布于世界 各地的所有盐田和高盐盐湖。无论两性生殖还是孤雌生殖，卤虫均有两种生产方式，一是卵胎 生，二是卵生。以卵生方式所产的滞育卵称为休眠卵，休眠卵为含有3000～4000个细胞的胚 胎，外包复杂的胚膜和外壳，能抵御各种不良环境，并且在干燥状态下可以长期保存。在适 宜水分及温度下可以恢复新陈代谢，孵化为无节幼体。在卤虫生活史中休眠卵的形成对卤虫 应对恶劣环境、种群繁殖起着重要的作用。

卤虫卵被作为基础研究的材料广泛应用于水生生物学、发育生物学、遗传学、生理学、 毒理学、放射生物学、生态学等学科的研究中，也是水产养殖中广泛使用的饵料生物。随着 水产养殖的快速发展以及科学研究的逐步深入，卤虫卵基础生物学研究倍受关注。

海藻糖(Trehalose)，又名蘑菇糖、覃糖，它的分子式为C₁₂H₂₂O₁₁·2H₂O，化学名α-D- 吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷(α-D-glycopyranosyl-α-D-glycopyranoside)，是由 两个葡萄糖分子通过半缩醛羟基缩合而成的非还原性双糖。广泛存在于细菌、酵母、真菌、 藻类和昆虫中。海藻糖具有独特的生物学功能，可以保护蛋白质，生物膜及敏感细胞的细胞壁 免受干旱、冷冻和渗透压的变化而造成的伤害，可作为不稳定药品、食品和化妆品的稳定剂、 多种食品和药品甜味剂、种子的包衣、冷冻干燥菌株的保护剂等；海藻糖还可保护DNA防止 放射线引起的损伤。

生物化学特性与卤虫卵的休眠密切相关，卤虫卵在开始休眠时合成具有保护作用的化合 物。研究发现卤虫休眠卵内贮存有大量的海藻糖，含量分别约为干卵重的15％～17％。海藻 糖对膜结构及对卵的超微结构的完整性具有重要的保护作用，可以抵御干燥对膜造成的破 坏。

海藻糖含量的测定在海藻糖工业生产和应用研究中起到了相当重要的作用，选用适当的 测定方法将对生产者和研究者起到事半功倍的效果。现在应用的海藻糖分析方法主要有纸层 析法、薄层层析法、高效液相色谱法、气相色谱法、蒽酮比色法、酶法等方法。

1、纸层析法

现在，纸层析法在生物化学特别是在糖类的分析中仍得到广泛的应用。纸层析法的关键 是选用合适的展开剂和显色剂，用于海藻糖分析的展开剂主要有：

正丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶2(v/v)

正丁醇∶乙醇∶丙酮∶水＝5∶4∶3∶2(v/v)

醋酸乙酯∶甲酸∶醋酸∶水＝30∶7.5∶7.5∶5(v/v)

正丁醇∶醋酸∶水＝5∶1∶2(v/v)

正丁醇∶甲酸∶水＝15∶3∶2(v/v)

酚水的上层饱和液

显色剂可用由AgNO₃的水-丙酮饱和溶液(水∶丙酮＝1∶200(v/v))与含1gNaOH晶体的 100g乙醇水溶液(乙醇∶水＝1∶1(wt/wt))两种溶液组成的显色剂。

2、薄层层析法

现在海藻糖的定性定量分析，国外主要借助于高效液相色谱，但在我国高效液相色谱还 不普遍的情况下，这一方法的应用往往受到实验室条件的限制，并且对于菌株筛选、培养及 提取过程中大量的海藻糖进行快速定性定量分析，完全依赖于高效液相色谱也不是一个高效 经济的方法，而用薄层层析法来对海藻糖进行定性定量分析则是十分便利的。应用时采用硅 胶GF254(200×50)板，选用正丁醇∶吡啶∶水＝15∶3∶2(v/v)为展开剂，以1g酚、5mL的 98％浓硫酸溶于100mL95％乙醇中作为显色剂，同样能很好的将海藻糖与葡萄糖、蔗糖等小 分子糖分开。同样还可以用正丁醇∶乙醇∶水＝2∶1∶1为展开剂、10％～15％硫酸溶液为显 色剂进行海藻糖的定性定量分析。

3、高效液相色谱法