[发明专利]一种血管瘤病变型J亚群禽白血病突变体病毒株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒研究领域，尤其涉及一种E元件(XSR)缺失血管瘤病变型J亚群禽白血病突变体病毒株及其构建方法。

背景技术

本发明人已经从血管瘤病变型禽白血病海兰褐蛋鸡中分离得到血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株，并获得了血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株的全长基因组序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株与ALV-J原型株HPRS-103在LTR(长末端重复区)有相似的特点，即与其它亚群禽白血病病毒相比，在其3’LTR区域存在一个具有被称作E元件的发夹颈环结构，该元件以前仅存在于急性转化型Rous肉瘤病毒src基因上游或下游，长约150bp。

E元件的功能目前还不十分清楚，但它含有转录因子c/EBP的黏着位点且可发挥增强子的功能。在对于自然分离的重组嵌合病毒ALV-J/A研究中发现，E元件与致瘤性有关，但这个研究是以自然分离株为研究对象的，自然分离株存在着众多的序列突变与缺失，而这些突变或缺失可能都会对病毒的致病性产生影响，从而影响了E元件在病毒致病性及其致病机理的研究。

本发明人根据血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列，构建得到含有该基因序列的质粒pSK-ALV-HN，其构建步骤如下：

(1)根据血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)设计六条特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6～11所示；

(2)利用核苷酸序列如SEQ ID NO：6～11所示的六条特异引物将血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)分三段进行扩增，并分别克隆于pMD18-T simple vector载体，构建得到三个质粒，分别命名为pHN-A-T、pHN-B-T和pHN-C-T；以SEQ ID NO1所示基因为模板，将血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株病毒液接种鸡胚成纤维细胞，7天后提取细胞总基因组DNA，做为模板，

(3)将质粒pHN-A-T、pHN-B-T分别用SalI和EcoRI双酶切消化，回收目的片段，经连接和转化后，挑取单一菌落鉴定克隆，将获得的重组质粒命名为pHN-(A+B)-T；

(4)将pHN-(A+B)-T和pHN-C-T分别用Kpn I和NotI双酶消化，回收目的片段，经连接和转化后，挑取单一菌落鉴定克隆，将最后获得的重组质粒命名为pMD18-ALV-HN，并测序验证，结果证明重组质粒pMD18-ALV-HN中含有血管瘤病变型ALV-J SCAU-HN06株前病毒全基因组序列；

(5)将质粒pMD18-ALV-HN中含有血管瘤病变型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因组序列亚克隆到pBlueskript SK(-)载体，得到含有血管瘤病变型ALV-J SCAU-HN06株病毒基因的质粒，并命名为pSK-ALV-HN。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株可用于E元件的病毒致病性及其致病机理研究的E元件缺失血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒株。

本发明的另一个目的在于提供上述血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒株的构建方法。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

一种血管瘤病变型J亚群禽白血病突变体病毒株，该病毒株为J亚群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已于2009年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V200914。

上述血管瘤病变型J亚群禽白血病突变体病毒株是采用感染型克隆技术，通过对血管瘤病变型J亚群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)进行E元件缺失，构建而得。

上述血管瘤病变型J亚群禽白血病突变体病毒株的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)特异性引物

特异性引物一共四条，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～4所示；