[发明专利]一种用于结核病预防的新型重组疫苗

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域和新型结核疫苗领域，具体涉及一种重组的卡介苗。

背景技术：

结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌引起的一种传染病，近年来随着流动人口增加、人类免疫缺陷病毒(HIV)与结核杆菌伴发感染以及结核杆菌多重耐药性菌株的出现，使全球结核病疫情增高，给全球结核病的防治提出了新的挑战。卡介苗(Bacille CalmetteGuerin，BCG)是目前唯一用于预防结核病的疫苗，但是其免疫保护效果极不稳定，不同地区的人群接种BCG后其免疫保护作用差异很大(保护率为0-80％不等)。开发比BCG更为有效的抗结核病疫苗已成为当今迫切需要解决的问题，但目前尚没有任何一种新型疫苗能完全替代BCG免疫，因此对卡介苗进行分子改造，研制更为安全有效的新型抗结核病疫苗具有重要的意义。BCG作为一种活疫苗，应用于免疫力低下的人群(如HIV感染者或艾滋病患者等)有较大的局限性，而将外源基因导入卡介苗构建重组卡介苗(rBCG)是TB疫苗改造的方向之一，通过BCG的生长繁殖，在体内表达保护性抗原，能更有效地激发机体免疫应答，增强BCG的免疫效果。Horwitz在BCG菌株中引入编码MTB 30kD主要分泌型和细胞外蛋白(Ag85B)的质粒来观察rBCG的效力，发现rBCG均能稳定表达这种蛋白分子，与亲本BCG免疫的豚鼠相比，rBCG免疫的豚鼠尽管体重变化不明显，但动物存活率和组织抑制细菌生长的能力均超过BCG，已计划开始进行I期人体试验。Bao构建了两株分别表达Hsp60-ESAT6融合蛋白和ESAT6分泌蛋白的rBCG，前者比BCG诱导更高滴度的特异性抗体和更强烈的细胞免疫应答，而后者的免疫原性与亲本BCG株相似，两株rBCG的毒力未见增强，都能明显抵御MTB感染，但免疫保护效力方面尚低于BCG。

MTB早期分泌抗原靶6(earlier secreted antigenic taget 6，ESAT-6)是分枝杆菌毒株培养液中的一种分泌蛋白，它是分枝杆菌感染的人或动物免疫回忆应答过程中T细胞识别的主要靶抗原之一，是MTB特有而BCG缺乏的一种小分子量分泌性蛋白，由位于MTB基因组的RD(Regions of deletion，RD)1位点上RV3875基因编码，该区只存在于结核分枝杆菌复合群和少数致病性分枝杆菌基因组中，所有BCG菌株基因组中均缺乏该区域，是BCG减毒传代过程中最先缺失的一段区域，与结核分枝杆菌毒力和抗原性相关，能被宿主免疫系统高度识别。ESAT6是一种重要的T细胞抗原，具有多个T、B细胞表位，能刺激免疫记忆细胞早期高效分泌IFN-γ，在MTB感染早期阶断即可被机体识别，可激活CD₄⁺T细胞和主要组织相容性抗原复合物(MHC)I类分子限制性CD₈⁺T细胞，在保护性细胞免疫中发挥重要作用，被看作是新型结核疫苗研究的优势抗原。

机体对结核病的免疫主要通过CD₄⁺T、CD₈⁺T细胞等的细胞免疫来完成，BCG是一种强的CD₄⁺T细胞型免疫应答诱导剂，但它诱导MHC I类限制性CD₈⁺T细胞的作用较弱，这可能是BCG的主要缺陷之一，而CD₈⁺T细胞可通过多种机制在宿主防御结核杆菌感染和潜伏感染中发挥重要作用。粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factorGM-CSF)是一种能够刺激粒细胞、巨噬细胞形成集落的细胞因子，可调控粒细胞、单核/巨噬细胞的分化、增殖和存活，激活单核-巨噬细胞、释放炎性介导因子，杀死某些微生物和肿瘤，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用。GM-CSF在体内外都能影响巨噬细胞的活性，促进树突状细胞发育，并增加其表面MHC分子的表达，有效促进抗原提呈，作为免疫佐剂已广泛应用于免疫学领域。利用GM-CSF作为佐剂的动物模型试验均表明，GM-CSF能增强感染的免疫原性，在与BCG一起免疫的小鼠中，GM-CSF能显著增强小鼠对结核分枝杆菌二次攻击的免疫保护作用。