[发明专利]表达IBDV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达IBDV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用。

背景技术

IBD(传染性法氏囊病)是由IBDV(传染性法氏囊病病毒)引起的危害雏鸡的一种急性、高度接触性传染病，是危害世界养禽业的主要传染病之一。主要侵害雏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，导致免疫抑制，从而增强机体对其它病原体的易感性和降低对其它疫苗的反应性。

目前世界上发生的IBD有两个血清型：血清I型和血清II型。血清II型毒株对鸡无致病性，血清I型中又可分为经典毒株(亦称标准血清I型)、变异株(亦称亚型毒株)和超强毒株。经典毒株以导致法氏囊的水肿为特征，世界各地广泛流行；变异株导致法氏囊的迅速萎缩，未见有水肿的过程，具有很强的免疫抑制作用；超强毒株导致法氏囊的严重出血，外观似“紫葡萄”样，死亡率高达70％以上。我国同时存在三种类型的IBDV毒株，从而给我国养禽业造成了巨大的经济损失。

IBDV属于双RNA病毒科、禽双RNA病毒属，基因组由A，B两个双链RNA节段组成。A片段长3.3kp，包括两个完整的阅读框架(ORF)，分别编码VP2-VP4-VP3三种病毒结构蛋白；B片段长2.9kp，有一个连续的开放阅读框架(ORF)，编码VP1蛋白。其中VP2是IBDV的主要结构蛋白，含有型特异性的，能诱导中和抗体的抗原决定族，是主要的宿主保护性抗原。

IBDV是目前严重威胁养禽业发展的一种重要的病毒。由于该病毒主要侵害雏鸡的中枢免疫器官-法氏囊，最终导致免疫抑制，从而增强机体对其它病原体的易感性和降低对其它疫苗的反应性，结果使疫情加重。近年来IBDV变异株与超强毒株的流行，传统的弱毒苗和灭活苗免疫失败常有发生。

目前对IBD疾病的控制尚无切实有效的方法，防制IBD的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，近年来IBDV变异株与超强毒株的流行，传统的弱毒苗和灭活苗免疫失败常有发生。因此发展新型疫苗来控制IBDV已是当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种为了解决上述问题，本发明提供一种重组杆状病毒及可作为预防IBD感染的亚单位疫苗。

本发明提供的一种表达IBDV免疫原基因的重组杆状病毒，带有SEQ IDNO.1所示的序列。所述重组杆状病毒表面展示IBDV结构蛋白VP2。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备VP2基因。制备方法为：用PCR方法扩增了IBDV陕西株VP2基因，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-VP2质粒；

b、将IBDV的VP2基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含IBDV的VP2基因的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-VP2；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-VP2转入大肠杆菌内进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA。作为优选，所述大肠杆菌为感受态大肠杆菌DH10Bac。

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。优选地，将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞Sf9中，包装出重组杆状病毒。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒在制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗中的应用。

本发明提供一种制备鸡传染性法氏囊病病毒疫苗的方法：重组病毒接种昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。上述昆虫细胞优选Sf9昆虫细胞。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的重组杆状病毒BacSC-VP2可表面展示IBDV结构蛋白VP2，直接经过超速离心得到杆状病毒的同时也就得到了目的蛋白，可以避免现有技术中表达系统(包括传统的杆状病毒表达系统)表达目的蛋白分离纯化的繁琐过程。而，现有技术的表达系统中表达的目的蛋白是分泌到Sf9细胞的培养基中，需要通过蛋白纯化系统来纯化目的蛋白，这样费时费力，代价昂贵，不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产，这也是目前蛋白表达最令人头疼的地方。

2、转座载体中添加eGFP基因，可以通过荧光显微镜直接观察荧光的有无来检测重组病毒的产生情况，大大简化病毒滴度的测定。

3、该重组杆状病毒表面展示的蛋白可与IBDV抗体发生特异性反应。

4、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-VP2可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫。