[发明专利]乙肝L基因和结核Esat6融合基因及其表达载体的构建与应用

权利要求书

1.一种乙肝病毒L基因和结核Esat6基因的融合基因，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.1所述。

2.一种包含了权利要求1所述的乙肝病毒L基因和结核Esat6基因的融合基因的玉米表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)引物设计：

根据乙肝病毒L基因的编码序列，设计扩增乙肝病毒L基因的1对引物：

上游引物序列为：P1 5′-ATTATT GGATCC ATGGGAGGTTGGTCTTCC-3′，含Kpn I酶切位点和起始密码子ATG；

下游引物序列为：P2 5′-CACTGCTGCTCTGTCATAATGTATACCCAAAGAC-3′，序列与P3反向互补；

根据人结核分支杆菌H37Rv株Esat6基因的编码序列，设计扩增结核杆菌Esat6基因的1对引物：

上游引物序列为：P3 5′-GTCTTTGGGTATACATTATGACAGAGCAGCAGTG-3′，序列与P2反向互补；

下游引物序列为：P4 5′-T GGATCC CTATGCGAACATCCCAGTG-3′，含BamH I酶切位点和终止密码子；

(2)将乙肝表面抗原阳性患者血清采用苯酚/氯仿抽提法获得DNA提取液，作为L基因扩增模板，用步骤(1)设计的引物P1和P2进行常规链式聚合酶反应，扩增出乙肝病毒L基因；

(3)提取人结核分支杆菌H37Rv基因组DNA作为模板，用步骤(1)设计的引物P3和P4进行常规链式聚合酶反应扩增结核杆菌Esat6基因；

(4)以步骤(2)所得乙肝病毒L基因和步骤(3)所得结核杆菌Esat6基因为模板，用步骤(1)设计的引物P1和P4进行部分重叠聚合酶链式反应扩增L-Esat6；

(5)pEG-G载体的构建：

以质粒pCR-G为模板进行常规链式聚合酶反应扩增得到玉米种子特异表达启动子Globulin-1，将分离纯化后的扩增产物与质粒pEGFP-C1分别用HindIII和Kpn I进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接、转化筛选获得pEG-G载体；

(6)中间载体pEGG-LE的构建：

将步骤(4)所得L-Esat6和步骤(5)所得pEG-G载体分别用Kpn I和BamH I进行双酶切，将分离纯化后的酶切产物进行连接、转化筛选获得重组载体pEGG-LE；

(7)重组载体pCAMG-L-Esat6的构建：

将重组载体pEGG-LE用HindIII和BamH I双酶切，分离纯化后得到G-L-Esat6；用HindIII和BamH I双酶切植物表达载体pCAMBIA1300，将分离纯化后的片段与G-L-Esat6连接、转化筛选获得重组载体pCAMG-L-Esat6。

3.根据权利要求2所述的玉米表达载体的构建方法，其特征在于：步骤(2)所述常规链式聚合酶反应具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、45s，55℃、45s，72℃、60s，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；所述混合液组成如下：

浓度为10umol/l的上游引物P1                1μl

浓度为10umol/l的下游引物P2                1μl

dATP、dTTP、dCTP、dGTP的浓度

各为2.5mM的dNTP混合物                        4μl

DNA提取液                                    5μl

Ex耐热性DNA聚合酶反应缓冲液                  5μl

Ex耐热性DNA聚合酶                            0.25μl

灭菌水                                       33.75μl。