[发明专利]乙肝L基因和结核Esat6融合基因及其表达载体的构建与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种乙肝病毒L基因和结核Esat6融合基因及其玉米表达载体和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒((Hepatitis B virus HBV)的感染是一个非常严重的全球性的健康问题。目前全球60亿人口中有20亿人感染过乙型肝炎病毒，占全球人口三分之一。约25％的人最终将转化为慢性肝病，包括肝硬化和肝癌。控制乙肝传播的主要手段是接种有效的疫苗进行预防和阻断传播途径，。目前应用的乙肝疫苗主要由中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)和啤酒酵母表达的乙肝病毒表面抗原HBsAg(S蛋白)颗粒组成。在预防接种的过程中发现仍有10％～20％人群接种乙肝疫苗表现为无反应或弱反应，甚至根本不产生抗体。随着年龄的上升，无反应或弱反应者增多，尤其是在艾滋病感染者、肾透析和免疫抑制病人中这种低反应或不反应的发生率会更高。另外，由于长期推广乙肝疫苗后，HBVS基因变异株以弱势准种形式广泛存在，有可能在免疫后人群中流行。

结核病是一种严重危害人类健康的传染性疾病，又称为痨病和“白色瘟疫”，由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis MTB)感染引起。球大约有三分之一的人感染过结核(大约21亿)，每年新发病1000万人，200人万死于结核病，平均15秒钟就有一人因肺结核面死亡。世界卫生组织预测，未来20年还将有3600万人死于结核病。移民、HIV感染、传播性强的新型结核菌株与多重耐药菌株的出现，使传统的抗痨药物已无法发挥有效作用是导致结核病发病率呈上升趋势的原因。我国是世界上结核病高负担国家，有5.5亿人感染过结核。肺结核的发病率在27种法定传染病中居第一位，病死率居第一位。卡介苗(BCG)作为预防结核病的疫苗，近100年来虽然广泛用于新生儿的预防接种，但保护率只有50％左右，而对成年人的保护率在不同地区，在0-80％之间波动：另外接种BCG还能使少数人发生较严重的并发症，发生播散性感染而致死。

鉴于乙肝与结核这两种疾病有可能在免疫后人群中流行而成为新的公共社会问题。加强乙肝病、结核病的防治宣传工作；探索乙肝病、结核病的早期诊断及研制开发预防、治疗乙肝病、结核病，其保护作用分别优于市售啤酒酵母HBsAg疫苗与BCG的新型疫苗已成为当前国际乃至我国关注的紧迫而优先的课题。

研究表明，乙肝病毒全包膜蛋白L(包含Pre1、Pre2、S基因编码蛋白)，其中preS1肽段含有好几个免疫原性比S蛋白更强的T细胞和B细胞表位，由preS1引起的细胞特异性的细胞免疫应答可以帮助克服某些人对S蛋白的免疫无反应状态或同时对preS1和preS2蛋白双重无反应状态；preS2中也含有多个抗原表位和病毒中和位点，在疫苗制剂中加入preS1和preS2的抗原表位后，人群对传统的乙肝疫苗的不反映和低反应频率大大降低，抗体产生的时间较仅有S区抗原的时间提前；因而含有乙肝病毒preS1和preS2抗原成分或HBV S基因变异株核心蛋白成分的各种新型重组乙肝疫苗具有更强的免疫原性，能诱导更高效的免疫应答，产生中和乙肝病毒抗体，保护机体免受病毒攻击，并可打破免疫耐受，清除乙肝病毒。

Esat-6，即6kD早期分泌抗原蛋白(Early secreted antigenic target 6-KDaprotein)是从MTB短期培养液中提取的一种低分子量分泌性蛋白，是由RD1区Y277基因(288bp)编码，含95个氨基酸，分子量9.904ku。Esat6是重要的T细胞抗原，编码该抗原蛋白的基因高度保守，基本不受感染MTB的宿主基因组的影响，并介导长期持久的免疫记忆。在结核病初期阶段，机体对MTB的记忆免疫应答中T6特异性T细胞高达25％～35％。Esat-6可以增强T细胞r干扰素的分泌，增强免疫应答。同时，Esat-6能显著活化巨噬细胞，提高巨噬细胞对胞内结核杆菌的生长抑制作用和杀伤能力。此外，Esat-6具有多个T、B细胞表位，能被不同的MHC分子识别。因此Esat-6作为结核优势抗原的候选基因应用于各类抗结核疫苗的研究。