[发明专利]溶菌酶活力的测定方法

权利要求书

1.一种溶菌酶活力的测定方法，其特征是；

A，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；

B，用MBTH法检测待测溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖后产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应的吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算溶菌酶的活力。

2.根据权利要求1所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤A的具体步骤是；分别取6-15组具有不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0.6mL，浓度范围在0-20微克/毫升之间，加入0.6mL 0.5当量的NaOH溶液，混匀，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热15-25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线。

3.根据权利要求1或2所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤B的具体步骤是；将壳聚糖-脱乙酰度在45％-55％的溶液其浓度为4-10mg/mL，加入到锥形瓶中于40-50℃的水浴摇床中预热8-12min，加入预热至相应温度的溶菌酶溶液开始水解反应，水解时间为60min以内，取水解液2mL，可在反应过程中分阶段取样，与2mL 0.5当量的NaOH溶液迅速混合以终止反应，从中取1.2mL加入到试管中，做三个平行样，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热20-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，根据步骤A制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定酶解产物中所含有的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖浓度，以此来推算溶菌酶的活力；溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系每分钟产生1nmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；其中MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。

4.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH₄(SO₄)₂)·12H₂O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。

5.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述壳聚糖的脱乙酰度为50％。

6.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述壳聚糖溶液以50mM的丁二酸或醋酸溶液为溶剂。

7.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述测定吸光度值的最佳波长为655nm。