[发明专利]溶菌酶活力的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种测定溶菌酶活力的方法，具体涉及用MBTH法测定溶菌酶活力的方法尤其涉及测定过程中关键参数的选择。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)主要来源于人、动物、植物、微生物以及蛋清中，是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它是一种有效的抗菌剂，它能切断肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。目前国内外报道检测溶菌酶的方法有多种，如琼脂板扩散法，比浊法，比色法，高效液相色谱法、琼脂糖火箭电泳法、共振散射光谱法等，其中比浊法是最常用的方法。比浊法以溶壁微球菌为底物，通过酶作用前后吸光度的变化来体现酶活力的大小。该方法繁琐，使用的溶壁微球菌悬液体系是由菌体颗粒和缓冲液组成的固-液相分布的不均匀的不稳定体系，在自然条件下该菌悬液也会发生自身解体。菌悬液在反应前预热时间长短，终止反应时间的控制等都会对结果产生影响。在比浊法中，细胞壁中的肽聚糖被溶菌酶水解成可溶性的碎片，虽然可以使溶液对光的吸收度减少，但仍有大量菌体悬浮在溶液中，由于菌体本身多方面的差异，故悬浮在溶液中的持续时间不同，导致溶液对光的吸收度变化较大，给测定结果带来一定的误差，从而限制了它的使用。也有采用DNS法、铁青化钾法，以高脱乙酰度的壳聚糖为底物进行溶菌酶的酶活力测定，但是，这些方法灵敏度均不够高，很难测到初速度，从而限制了其应用。

本发明选用化学结构与肽聚糖结构非常近似的半脱乙酰壳聚糖(脱乙酰度在45％-55％)为溶菌酶的水解底物，以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)为显色剂来测定溶菌酶的活力。该法不受低浓度醋酸盐和琥珀酸盐缓冲液的干扰，对于不同聚合度的同类还原糖，其还原端的显色吸光系数基本相同。

发明内容

针对已有技术的不足，本发明提供一种溶菌酶活力的测定方法，该方法采用3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法来测定溶菌酶的活力。

以下详细介绍本发明一种溶菌酶活力的测定方法，A，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖后产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算溶菌酶的活力。

优化地；上述步骤A的具体步骤是；作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度标准对应关系曲线；分别取6-15组不同浓度(0-20μg/mL)的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0.6mL，加入0.6mL 0.5当量的NaOH溶液，混匀，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定N乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；

优化地；上述步骤B的具体步骤是；用MBTH法检测溶菌酶的活力；将半脱乙酰壳聚糖溶液其浓度为4-10mg/mL，加入到锥形瓶中于25-40℃的水浴摇床中预热8-12min，加入预热至相应温度的溶菌酶溶液进行水解反应，水解时间为60min以内，取水解液2mL(可在反应过程中分时间段取样检测)，迅速与2mL 0.5当量的NaOH溶液充分混匀以终止反应，取1.2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0.6mL于75-85℃水浴加热15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1.2mL，室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值，根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖的浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌酶的活力；溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系，每分钟产生1nmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。其中MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和1mg/mL的二硫苏糖醇溶液等量混合即得，现用现配，一天内有效。

优化地；上述硫酸铁铵试剂的制法是0.5％(FeNH4(SO4)2)·12H2O，0.5％氨基磺酸，0.5当量盐酸。

优化地；上述壳聚糖的脱乙酰度为50％。