[发明专利]棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法

权利要求书

1.一种陆地棉花粉管游离钙离子的荧光标记方法，包括以下步骤：

1)载玻片打孔

将25.5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔， 其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；

2)荧光探针Fluo-3AM的溶解

50μg的Fluo-3AM，用44ml含有质量比20％surfactant pluoronic F-127的无水 二甲亚砜溶解，配制成1mmol/L的母液；

3)培养花粉管

晴天上午收集刚开放花朵上的花粉，使其充分混合；每1ml培养液中加入5mg 花粉粒将花粉和培养液混合；培养液质量比成分：0.01％硼酸+0.03％四水硝酸钙 +0.02％七水硫酸镁+15％聚乙二醇8000+20％蔗糖，pH6.2，装入离心管内，使 花粉粒充分混入培养液，28℃光照培养1-2h；

4)低温孵育法装载荧光探针Fluo-3AM

取1μL Fluo-3AM母液，加入到50μL培养过的花粉悬浮液中，振荡混匀至 Fluo-3AM终浓度为20μmol/L，置于4℃冰箱中低温孵育1-2h，然后用原培养液低 速离心洗涤3次，以去除未装载进细胞内的Fluo-3AM，最后在温度25℃静置1-2h， 使已进入细胞内的Fluo-3AM在胞内酯酶的作用下充分水解为能与游离钙离子结合 的离子形态；

5)激光共聚焦显微镜观察

将装载有荧光探针Fluo-3AM的陆地棉花粉细胞悬浮液滴加在载玻片上的小室 中，上面盖盖玻片；将载玻片放在配备50mV氩激光器的Zeiss LSM Leica TCS-SP2 型激光共聚焦显微镜的载物台上，以Kr/Ar激光为激发光源，激发波长488nm，发 射波长522nm，Nikon物镜20×/0.5，Nikon目镜10×/25，调节焦距选取视野内一个 完整的花粉管，再调节微调直至花粉管图像清晰，通过计算机控制扫描和数据采集 系统Timecourse，对该层面上钙离子荧光强度和分布随时间的变化情况进行观察， 图像采集采用256×256像素，循环次数为73次，间隔5s，共计6min，采集的图象 和数据记录于计算机中；

6)图像处理

储存于计算机中的图象文件，用与激光共聚焦显微镜配套的Laser Pix分析软件 Version 4.0对所获得的Timecourse扫描图进行分析：分别圈定一个顶端0-30μm的 花粉管顶端区域A，顶端＞30μm的近顶端区域B和背景区C，经此软件读出花粉 管顶端A，近顶端B和背景区C的钙离子荧光强度相对值，此荧光强度相对值的变 化反映花粉管内游离Ca²⁺的浓度变化；用Excel软件导出此花粉管顶端和近顶端选 定区域的相对荧光强度的变化值，以时间为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，即可 作图，此花粉管顶端和近顶端选定区域的荧光强度值即代表相应区域游离Ca²⁺的浓 度相对值。