[发明专利]棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及植物生物技术领域中花粉管游离钙离子的荧光标记方法，属于生物 技术领域。

二、背景技术

细胞内的游离钙离子是细胞感受刺激的第二信使，它的浓度可以响应外界环境 刺激而迅速变化，进而引起钙离子下游的靶蛋白如CaM(钙调素)、CDPK(CaM 依赖的蛋白激酶)等活性的变化，调节细胞内许多生理生化反应，从而转导细胞感 受的胞外刺激，以适应环境。花粉的萌发与花粉管的伸长生长是一个复杂的生理生 化反应过程，该体系已被越来越多地用作研究细胞生长的分子调控机理，近年来的 许多研究结果证明细胞内的游离钙离子参与了这一过程。在此过程中，[Ca²⁺]_i的时 空变化表现了复杂多样的调控作用，因而[Ca²⁺]_i的测定显得极为重要。

目前荧光测定植物细胞[Ca²⁺]_i变化的方法虽然已经有很多成功报道，但由于植 物细胞具有细胞壁、叶绿体和大液泡，当把应用于动物细胞的荧光指示剂应用于植 物细胞时，在引入荧光指示剂问题上遇到极大的局限。显微注射法对细胞伤害较大， 且对仪器要求较高；近年来虽然有报道用低pH渗透法把荧光指示剂引入植物细胞 中，但低pH同样对细胞造成一定程度的伤害，且负载成功率低。植物细胞的细胞 壁中还存在着非特异性酯酶，会迅速将酯化型探针分解为离子型，使之很难进入细 胞，如果细胞内染料过少，则不能在细胞内钙离子发生变化时显示出相应的荧光强 度变化，将会影响测定的准确性。

已广泛使用的游离Ca²⁺荧光指示剂有游离酸和乙酰甲基(acetoxy methyl，AM) 酯化两种形式。游离酸形式的指示剂不能透过细胞膜却能与Ca²⁺结合，并在与Ca²⁺结合时荧光峰值发生变化。AM酯化形式的Ca²⁺指示剂能通过细胞膜进入细胞浆 内，而不能与Ca²⁺结合。当活细胞与AM形式指示剂孵育时，因为酯类物质具有 较高的亲脂性，可以穿透细胞膜进人胞浆，而后又能被细胞内特定的酯酶水解成游 离酸形式，而这些游离酸形式的指示剂可与细胞内游离钙结合形成复合物，使这些 染料的荧光光谱发生量的变化，且因为荧光染料与钙解离容易，随着游离钙的增加 或减少，其荧光强度随之变化。所以经洗涤，去除细胞外染料和校正细胞的自动荧 光后，负载有染料的细胞的荧光强度可反映细胞内钙离子浓度。但植物细胞的细胞 壁中存在着非特异性酯酶，会迅速将酯化型探针分解为离子型，使之很难进入细胞， 如果细胞内染料过少，则不能在细胞内钙离子发生变化时显示出相应的荧光强度变 化，将会影响测定的准确性。为了消除细胞壁对装载的影响，多数试验中人们都采 用原生质体作材料以解决这一问题。但以原生质体为材料不能真实反映植物细胞的 变化，且制备有活性的原生质体的要求苛刻。迄今为止，由于实验材料自身的局限 性和检测方法的局限性，对陆地棉花粉管中游离钙离子进行标记的有效方法和技术 还未见报道。本方法探索了用4℃低温孵育装载的方法将荧光探针Fluo-3AM导入 棉花花粉管中，使花粉管细胞壁酯酶保持较低的活性，保证有足够数量的Fluo-3 进入细胞内，以便更准确地反映细胞内游离钙离子的变化。

本方法操作步骤简单；荧光探针易导入细胞，为非损伤性测量法；荧光图像分 析技术可提供细胞内钙离子分布的二维或三维图像，可实时显示，空间分辨率优于 其他方法；试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得 到很好的应用。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于提供一种较快速、有效的的棉花花粉管游离钙离 子的荧光标记方法。

技术方案

一种棉花花粉管游离钙离子的荧光标记方法，包括以下步骤：

1)载玻片打孔

将25.5×76.2mm，1mm-1.2mm厚的载玻片中间用电钻打出直径为1cm的圆孔， 其中将孔一边用盖玻片封住，形成小室，粘附剂为指甲油；

2)荧光探针Fluo-3AM的溶解

50μg的Fluo-3AM，用44ml含有质量比20％surfactant pluoronic F-127的无 水二甲亚砜溶解，配制成1mmol/L的母液；

3)培养花粉管