[发明专利]用于检测致病疫霉的引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种致病疫霉的检测引物、包含该引物的检测试剂盒以及检测方式，属于生物技术领域。

背景技术

由致病疫霉(Pyhtophthora infestans(Mont.)de Bary)引起的晚疫病是世界马铃薯和番茄生产上毁灭性病害之一。在温度适宜病害发生的条件下，该病害可导致作物大幅减产甚至绝收。传统的检测植物病害的方法包括直接观察植物组织的发病症状或者分离得到病原物后再进行形态学鉴定。然而直接观察会遗漏发病初期未表现出症状的情况，而且由疫霉菌引起的病害很容易与Pythium spp.，Fusarium spp.和Rhizoctonia spp.引起的病害症状相混淆。因此，对于疫霉菌诊断来说，分离得到病原菌的纯培养是非常有必要的。但是，疫霉菌的分离一直比较困难，特别是对于致病疫霉的分离，更是对分离技术提出了较高要求。同时，疫霉菌的鉴定工作也比较困难，因为可以用于鉴定的形态学特征的数目很少，且容易受到环境因素的影响，使得许多疫霉种的鉴定出现了错误。分子检测的出现为植物病害的快速、准确诊断提供了新的思路和方法。近年来，基于PCR的植物病原菌分子检测技术在植物病害防治中起着越来越重要的作用。转录间隔区(ITS)是通常用来作为植物病原菌分子检测的主要靶标之一。但是越来越多的研究发现，部分疫霉菌的ITS序列差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将这部分疫霉菌与其近缘种区分开。除ITS序列之外，线粒体基因Cox1-Cox2和可能编码储存蛋白的Lpv基因也分别被用来作为少数疫霉菌的分子检测靶标。但是Lpv基因在除了隐地疫霉之外的其他疫霉中的研究比较少，不像ITS序列那样几乎所有的疫霉种都可以从GenBank中获取其序列。而线粒体基因在不同疫霉种间变异较小，且GC含量比较高，有些甚至达到了89％，并不适合用来作为多数疫霉种的分子检测靶标。因此，发掘新的分子检测靶标，对于完善植物病原菌分子检测体系及提高我国植物病害管理水平具有重要意义。

近年来，随着疫霉菌基因组学的迅速发展，越来越多的新靶标被用于疫霉菌的分子检测。在新发现的靶标中，Ypt1因其自身特点，被认为是一个非常适合作为疫霉菌分子检测靶标的基因。Ypt1是一个Ras相关基因，在酵母中，该基因编码一个与Ras相关GTP结合蛋白。Ypt1基因包含多个内含子，其基因序列保守区和进化区相互间隔，这一特点使得该基因适合作为分子检测的靶标。Schena等分析了29个疫霉种43个菌株的Ypt1基因的序列，认为Ypt1基因可以作为疫霉菌分子检测的靶标基因。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测致病疫霉的引物、包含该引物的检测试剂盒及检测方法，利用该引物及检测方法检测致病疫霉准确性高、特异性强、灵敏性高。

本发明提供的技术方案是：一种用于检测致病疫霉的引物，即PiF/PiR，其为致病疫霉的特异性引物，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQID No.2所述。

一种检测致病疫霉的试剂盒，包含所述的特异性引物。

上述的试剂盒，还包含4种dNTP，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA和Taq酶。

一种利用上述的引物检测致病疫霉的方法，其过程是：提取待测样品的DNA作为模板，利用所述的特异性引物进行PCR反应，取PCR反应扩增产物进行凝胶电泳，电压为50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果，如果存在分子量约为369bp的DNA条带，则证明所检样品中含有致病疫霉。

为提高检测的灵敏度，本发明还提供了另一种用于检测致病疫霉的引物，其包括两对引物，第一对引物即：PiF/PiR，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二对引物为疫霉菌Ypt1基因通用引物，即：Yph1F/Yph1R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述。

本发明还提供另一种检测致病疫霉的试剂盒，其包含上述的第一对引物和和第二对引物。

上述的试剂盒，还包含4种dNT，10×PCR反应缓冲液，2mM Mg²⁺，1％BSA，吐温-20和Taq酶。