[发明专利]一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种香菇菌病毒检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒它包括①、食用真菌病毒 RNA提取试剂，包括液氮、十六烷基三甲基溴化铵提取液、2-硫醇基苯并噻唑、氯仿、 异戊醇、0.1％w/v焦碳酸二乙酯、无水乙醇、70％v/v乙醇、三羟甲基氨基甲烷-乙二 胺四乙酸缓冲液pH 8.0；

其中，十六烷基三甲基溴化铵提取液的配方为：2％w/v十六烷基三甲基溴化铵，2％w/v 聚乙烯吡咯烷酮，100mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.0，25mM乙二胺四乙酸， 0.5g/L亚精胺，2.0M氯化钠，2％v/v巯基乙醇；

所述的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH 8.0由焦碳酸二乙酯处理的水配制；

②、RT-PCR检测试剂为：100μmol/L四种三磷酸核苷混合液、三羟甲基氨基甲烷- 盐酸缓冲液pH 8.8、从香菇样品中提取的RNA模板、无RNA酶去离子水、酶混合试剂和 三对RT-PCR特异性引物；

其中，酶混合试剂包含莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶和DNA聚合酶Taq酶或高保真 DNA聚合酶Pfu，两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2；

三对RT-PCR的特异性引物分别为：

第一对引物为：LEV F1：5′-ACAAAAAGCAAAAGCCGAGAGC-3′，

LEV R1：5′-ATTGCGAAGAAGCCCGTAAGAT-3′；

第二对引物为：LEV F2：5’-TCTTACGGGCTTCTTCGC-3’

LEV R2：5’-TGATTCGGGAGAGGGACT-3’；

第三对引物为：LEV F3：5′-CTAAGGCAAAGTCCAGGCACA-3′，

LEV R3：5′-TGCGTTGGGAGCTCTTCCGATAAC-3′；

③对照样品包括阳性对照样品和阴性对照样品，阳性对照样品是武香异常株WL 香菇菌丝体，试验确定含有香菇病毒颗粒和病毒核酸，阴性对照为浙江正常株JL-0香 菇菌丝，试验确定不含病毒颗粒和病毒核酸序列，试剂盒在-20℃以下的冰箱中保存。

2.权利要求1所述的一种香菇菌病毒检测试剂盒的检测方法，其步骤是：

第一步，从待测样品香菇菌丝体或子实体中提取总RNA，提取方法是：

(1)、待测样品0.1-0.2克，放置于1.5mL离心管中，液氮冰冻；

(2)通过振荡器剧烈震荡，用玻璃棒将菌丝体或子实体样品研碎，细度达50-80 目；

(3)、加入0.4-0.6mL十六烷基三甲基溴化铵提取液匀浆，再加入2-硫醇基苯并 噻唑至终浓度为2％w/v，振荡混匀；

(4)、45-65℃温育30-60min，再加入0.4-0.8mL氯仿，混匀5-10min；

(5)、8000-15000g离心5-10min，上层水相移到一个新离心管中；

(6)、加入0.5-1.5倍体积的异丙醇，混匀，-20℃放置30-60min；

(7)、8000-15000g离心10-20min，弃去上清；

(8)、70％v/v乙醇洗涤沉淀，8000-15000g离心2-5min，再用无水乙醇洗涤；

(9)、弃去上清，真空干燥5-15min；

(10)、沉淀溶于30-100μL三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液pH8.0中，-20 ℃保存备用；

第二步，以提取的总RNA为模板，用设计的第一对和第二对引物分别对RNA进行 RT-PCR扩增；

RT-PCR反应体系包括：

进行RT-PCR的反应条件是，首先42-50℃反转录30-60min，然后94℃变性3min； 以94℃ 30sec，50-58℃ 1min，72℃ 1min为一个循环，共进行30-35个循环；最后 72℃延伸5-10min；

反应中使用的反转录酶为莫洛尼鼠类白血病毒反转录酶，DNA聚合酶使用Taq酶或 高保真DNA聚合酶Pfu，酶混合试剂中两种酶混合的酶单位比例为U∶U＝1∶0.5-2；

第三步，取PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，判断样品：

两条扩增条带的分子大小为400bp和600bp，则待测样品为阳性；两对引物都没有 扩增产物，则待测样品为无病毒样品；两对引物PCR检测结果只有一对引物的结果呈 阳性，则将这对引物换为第三对引物，与第一次检测时呈阴性的引物分别对待测样品进 行第二次RT-PCR，反应条件与第一次RT-PCR的条件相同；第二次PCR结果只要任何 一对引物的结果呈阳性，都判断待测样品有病毒污染。