[发明专利]一种香菇病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种农业生物技术，具体地说，涉及检测香菇病毒所用的PCR引物和准 确快速检测香菇病毒的RT-PCR检测试剂盒，同时还涉及香菇病毒的检测方法，适用于 香菇菌种的病毒检测和香菇生产中早期病毒的检测。

背景技术

香菇是著名的食药兼用菌，也是我国栽培的主要食用真菌之一，随着国际市场的开 拓和国内消费的不断增加，生产呈逐年上升趋势。从上世纪末到本世纪初，我国年产鲜 香菇140多万吨。产量和出口量都居世界第一位。地处浙江南部山区的丽水市是世界人 工栽培香菇的发源地，鲜香菇年产量40-45万吨，年出口超过20万吨，是目前全球最 大的香菇产销集散地。香菇的生产和出口已成为部分县农业支柱产业和农民致富的重要 途径。

随着香菇栽培规模扩大，近年出现不同程度的香菇病毒病危害，给菇农带来惨重经 济损失。香菇病毒在菌丝体和营养生长阶段感染，轻度感染病毒的症状一般较为隐蔽， 外观上不易识别。严重带毒菌株开始表现也不明显，后期则表现为菌丝生长速度慢，形 状不整齐，局部伴有缺刻或菌丝紊乱的现象。香菇在子实体生长阶段感染病毒，带毒菌 丝对不良培养环境的适应性降低，尤其是抵抗霉菌侵染的能力下降，不能萌发成子实体 或发育成畸形菇。菌丝体生长缓慢，长势减弱，子实体畸形，质量和产量严重下降。病 毒感染菌株培养后期的纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶活性和对木屑培养料中纤维素、 半纤维素、木质素的降解能力比其正常菌株明显下降。

香菇病毒的发生不仅使香菇的产量下降、品质降低，产品难以出口，特别是香菇病 毒病早期不容易辨认，或症状时隐时现，一旦肉眼发现香菇发生病毒病，往往已到了香 菇生产的中后期，这样对香菇的生产造成的损失就十分巨大。同时，由于香菇病毒病发 现较晚，也对香菇菌种的无病毒育种提出严峻挑战，对高质高产香菇菌种无病毒培育造 成重大威胁。因此，急需开发香菇病毒病的早期快速检测方法，从而保证香菇生产在无 病毒感染的条件下持续生产，促进全国各地香菇生产和出口。

关于香菇病毒的研究，早在上世纪70年代就有报道。1972年，日本学者从栽培香 菇中分离到香菇病毒。1992年，我国学者也从香菇中分离到香菇病毒。这些研究主要是 从形态学上进行观察，并没有进行深入的分子生物学研究，只有沈学仁等从球形香菇病 毒中提取出病毒核酸，确定病毒核酸类型是RNA。由于香菇病毒基因组核酸序列的研究 还是空白，国际病毒分类委员会2005年公布的第八次报告中，香菇病毒仅作为未分类 病毒列出。香菇病毒的检测目前主要是通过电镜观察检测，另有一些酶法检测的试验报 道。

香菇栽培在国内外都有较长的历史，但直到上世纪八十年代，香菇栽培主要是段木 栽培，从上世纪九十年代以来，香菇栽培一般都改为代料栽培。以代料栽培方式栽培， 香菇生长的营养条件和环境条件都发生了巨大变化。随着香菇代料栽培的迅速增加扩 大，病毒病在香菇生长的不同阶段都有出现，对香菇产业的健康持续发展构成威胁。为 了开发方便快速的香菇病毒检测方法，近年来我们对发生在浙江、福建等地的香菇病毒 病进行了研究，发现代料栽培的香菇中，病毒主要是是长杆形颗粒，大小为20nm× 100-200nm。病毒基因组为双链RNA分子，大小约8.0kb，随后完成了香菇病毒部分基 因组的序列分析(Accession no：GQ372842)。这些工作为开发新的香菇病毒检测方法奠 定了很好的基础。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种香菇病毒检测试剂盒，该试剂盒组成成分简单，检 测灵敏度高，结果准确，可在香菇菌种制备阶段或香菇栽培早期就对香菇病毒进行快速、 灵敏、准确的检测，大大减少了香菇生产中病毒病造成的危害。

本发明的另一个目的是在于提供了一种香菇病毒检测试剂盒的检测方法，用本发明 提供的检测方法，反转录(RT)和PCR一步完成，操作简单方便；使用多对特异性引 物进行RT-PCR，可有效排除假阳性出现。香菇病毒检测方法所需的试验条件简单，不 需要电镜、超速离心机等大型仪器设备，在一般食用真菌菌种生产单位和基层研究单位 都可满足这些试验条件，有利于本发明在香菇栽培地区大范围推广应用。

为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种香菇菌病毒检测试剂盒由以下成分组成，分别是：