[发明专利]鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于鉴别PRV的试剂盒，尤其涉及一种快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，属于PRV的检测领域。

背景技术

PRV能引起多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疾病。猪是PRV的贮存宿主和传染源，主要引起妊娠期母猪流产，死产、木乃伊胎；初生仔猪多为急性致死性经过，具有明显的神经症状，死亡率几乎为100％；成年猪多呈潜伏感染。免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略，我国目前应用比较多的是用Bartha-K61株制备的弱毒疫苗。PRV弱毒疫苗虽然能有效地阻止感染后临床症状的出现，但接种猪仍可能被强毒感染，感染能形成潜伏和随后潜伏感染的病毒能被激活和引起散播。因此，建立PRV的早期快速鉴别基因缺失弱毒疫苗毒和野毒感染的抗原检测方法十分重要。

PRV的抗原检测方法很多，如病毒分离、荧光定量PCR、胶体金抗原检测试纸条。但病毒分离耗时费力，荧光定量PCR检测成本高且需要借助一些特殊的试验仪器的辅助才能完成，胶体金抗原检测试纸条虽然快速但敏感性不高。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，以解决现有技术存在的需要借助一些特殊仪器的辅助才能完成检测，稳定性较差、操作麻烦、效率低、需低温保存、储运不方便的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种快速检测和鉴别PRV gE缺失疫苗株和野毒株的环介导等温扩增试剂盒，其组成成分包括：等温反应混合缓冲液，DNA聚合酶，蒸馏水，引物混合物1和引物混合物2；其中，所述的引物混合物1由3对引物按照等摩尔比组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示，第3对引物的序列分别为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；所述的引物混合物2由3对引物按照等摩尔比组成，第1对引物的序列分别为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，第2对引物的序列分别为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示，第3对引物的序列分别为SEQ I D NO：11和SEQ ID NO：12所示。

其中，所述的等温反应混合缓冲液是2×U的等温反应混合缓冲液，包括以下组分：40mM Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、0.2％ TritonX-100，5mM dNTP，5M甜菜碱；为了达到更好的效果，所述的等温反应混合缓冲液中还可以含有稳定剂和增强剂等其它成分。

所述的DNA聚合酶优选为Bst DNA聚合酶。

为了达到更好的检测效果，本发明的试剂盒还可以含有PRV野毒的阳性对照PRV-PMD18T-gE质粒和PRVgE缺失疫苗株阳性对照质粒PRV-PMD18T-gG质粒；这两个质粒的构建方法如下：首先合成PRV-GE基因和PRV-GG基因的引物，引物序列如下：

GE-FP：5’-CGGCTTCGACGTCTGGTT-3’；

GE-RP：5’-GCGGTCACGCCATAGTTG-3；

gG-FP：5’-CGATGAAGTGGGCAACGTGG ATCCTC-3’；

gG-RP  5’-CGTCAGGCGGAGGCCACGTGGCGGTA-3’；

以PRV野毒PRV-JX株(可以从市场上购买，例如：中国兽医微生物菌种保藏管理中心)和PRV弱毒PRV-Bartha株(可以从市场上购买，例如：中国兽医微生物菌种保藏管理中心)DNA为模板，PCR扩增目的片段，然后分别胶回收目的片段，克隆到PMD18T载体上，然后转化DH5α感受态细胞，筛选阳性菌落，摇菌扩增，质粒提取试剂盒提取目的质粒。构建的质粒易保存，不具有感染性，无散毒的危险性，可以替代全病毒的DNA作为阳性模板；

优选的，本发明检测试剂盒的各组成成分的体积及保存条件如下：