[发明专利]一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法

权利要求书

1.一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法，包括以下步骤：

(1)通过离心去除奶牛精液中的精浆；

(2)奶牛精子的荧光染色：将去除部分精浆的牛精子按一定比例与荧光染料混合，34℃水浴45分钟；

(3)通过流式细胞仪分离染色的牛精子。

2.如权利要求1的染色方法，其中，所述步骤(1)是将奶牛原精直接离心后吸弃上层的精浆或者先用缓冲液稀释奶牛原精，然后进行离心并吸弃上层的精浆。

3.如权利要求2的染色方法，其中，所述稀释奶牛原精的步骤包括将4亿奶牛原精添加到15ml离心管中，用缓冲液稀释至3.0ml，1600rpm离心5分钟，分别吸弃0.5ml，1ml，1.5ml和2ml上清液。

4.如权利要求1的染色方法，其中，所述分离操作过程如下：

a)分离机型号为SX-Moflo或XDP，产地为美国；

b)分离模式选择Purify 1；

c)把样品置于加样站中，打开加样器上的压力和样品开关，按boost使样品从tip流出，调整样品压力使trigger rate保持在30000以下；

d)精细调整图形达到最清晰，一旦开始分离不可以移动影响dropdelay的旋钮；

e)Summit4.0软件上选择分离，R2选取X区域；

f)约15分钟摇动收集管，保证精子活力，每管样品分离时间不超过1小时，并记录机器状态和分离情况。

5.如权利要求3的染色方法，其中，所述缓冲液的组分为：

HEPES，浓度9.52×10^-3g/ml，摩尔浓度40.00mM；

氯化镁六水合物结晶，分子式MgCl₂·6H₂O，浓度0.08×10^-3g/ml，摩尔浓度0.40mM；

氯化钠，分子式NaCl，浓度5.518×10^-3g/ml，摩尔浓度95.00mM；

氯化钾，分子式KCl，浓度0.224×10^-3g/ml，摩尔浓度3.00mM；

无水磷酸氢二钠，分子式Na₂HPO₄，浓度0.04×10^-3g/ml，摩尔浓度0.30mM；

碳酸氢钠，分子式NaHCO₃，浓度0.84×10^-3g/ml，摩尔浓度10.0mM；

丙酮酸，浓度0.22×10^-3g/ml，摩尔浓度2.00mM；

葡萄糖，分子式C₆H₁₂O₆，浓度0.90×10^-3g/ml，摩尔浓度5.00mM；乳酸，60％Syrup，单位ml，浓度3.61×10^-3g/ml，摩尔浓度25.00mM；

牛血清白蛋白，浓度3.0×10^-3g/ml；

0.25ml的浓度为10mg/ml的庆大霉素溶液。

6.如权利要求1的染色方法，其中，所述荧光染料是Hochest33342。

7.如权利要求1的染色方法，其中，所述奶牛精子与荧光染料的比例为1亿个精子：4～5微升荧光染料。