[发明专利]一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞及生殖生物技术领域。适用于利用流式细胞仪进行奶牛精子分离、生产性控冻精。

背景技术

目前，基于流式细胞仪的精子分离是奶牛或肉牛的性别控制的有效技术和手段，而精子的荧光染色是分离过程的必要和关键步骤。哺乳动物性别控制是人们一直以来感兴趣并进行了大量、广泛研究的课题，经过长期的研究现已证明，基于流式细胞仪的精子分离是最成功并且最具实用性的性别控制技术。这项技术在多种哺乳动物获得成功，在包括中国在内的多个国家进行了推广使用，在奶牛的性别控制中已经或正在发挥着巨大的作用。使用荧光染料对精子进行染色，是利用流式细胞仪分离牛X/Y精子的关键性步骤，染色效果的好坏不仅极大地影响精子分离效果、效率，而且决定了种公牛的利用率。现在包括该技术的发源地美国在内的其它国家利用该技术种公牛的利用率仅为30％左右。

我们的研究证实原精里的精浆对染色有很大的影响，适当去除部分精浆能够十分有效地提高染色效果。生产实践中使用去除部分精浆的染色方法不但可以提高分离效果、分离速度，并且使种公牛的利用率从30％提高到90％以上。文献检索和资料查询未发现国内外有相同或类似的任何技术报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于奶牛精子分离的荧光染色方法，该方法提高了精子的分离效果和分离速度。

本发明的用于奶牛精子分离的荧光染色方法，包括以下步骤：

(1)通过离心去除奶牛精液中的精浆；

(2)牛精子的荧光染色：将去除部分精浆的奶牛精子按一定比例与荧光染料混合，34℃水浴45分钟；

(3)通过流式细胞仪分离染色的奶牛精子。分离操作过程如下：

a)分离机型号为SX-Moflo或XDP，产地为美国；

b)分离模式选择Purify 1；

c)把样品置于加样站中，打开加样器上的压力和样品开关，按boost使样品从tip流出，调整样品压力使trigger rate保持在30000以下；

d)精细调整图形达到最清晰，一旦开始分离不可以移动影响dropdelay的旋钮；

e)Summit4.0软件上选择分离，R2选取X区域；

f)约15分钟摇动收集管，保证精子活力，每管样品分离时间不超过1小时，并记录机器状态和分离情况。

所述去除奶牛精液中的精浆的步骤可以是将奶牛原精直接离心后吸弃上层的精浆或者先用缓冲液稀释奶牛原精，然后进行离心并吸弃上层的精浆。

所述稀释奶牛原精的步骤包括将4亿奶牛原精添加到15ml离心管中，用缓冲液至3.0ml，1600rpm离心5分钟，分别吸弃0.5ml，1ml，1.5ml和2ml上清液。

所述缓冲液组成为：