[发明专利]利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法

权利要求书

1.一种利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法。其特征在于：将巨大芽孢杆菌接种于斜面培养基培养后，再接入种子培养基培养，然后将种子液接入转化培养基；待巨大芽孢杆菌在转化培养基中繁殖后，加入底物雷帕霉素，经过巨大芽孢杆菌对雷帕霉素的转化，获得巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液，转化液中包含29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素及其他雷帕霉素衍生物。

2.根据权利要求1所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的斜面培养基为营养琼脂、沙保罗琼脂、高氏1号琼脂、精氨酸琼脂和ISP3琼脂；巨大芽孢杆菌在斜面培养基中的生长条件为pH5.5～8.0，生长温度20～40℃，培养时间15～24小时。

3.根据权利要求1所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：所述的种子和转化培养基均为：碳源可以是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖、玉米淀粉、可溶性淀粉、糊精等等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基中含碳源2～5克；氮源可以为黄豆粉、黄豆饼粉、花生饼粉、酵母粉、酵母浸出物、蛋白胨、聚蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、棉籽粉等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基含氮源0.5～2克；无机盐选择硝酸钠、硝酸钾、氯化钠、氯化镁、氯化铵、硝酸铵、钼酸铵、硫酸锌、硫酸镁、碳酸钙、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等任意一种或2～3种搭配使用，100毫升培养基中无机盐0.1～0.2克；种子培养过程采用的pH6.0～8.0，培养温度20～40℃；转化过程采用的pH5.0～6.5，温度26～32℃；移种量为1～5％。

4.根据权利要求2或3所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适种子和转化培养基均为1000毫升培养基含可溶性淀粉24克、葡萄糖1克、蛋白胨3克、酵母浸出物3克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克，pH自然。

5.根据权利要求4所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适种子培养条件为pH6.5～7.5，温度28℃，培养时间：一级种子15～18小时，二级种子8～10小时，移种量为2～3％。

6.根据权利要求5所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的最适转化培养条件为pH5.5～6.0，温度28℃，加入转化底物雷帕霉素后，转化周期63～65小时。

7.根据权利要求6所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素时使用的转化底物雷帕霉素事先溶解在二甲亚砜、甲醇或乙醇中，雷帕霉素母液浓度10～20mg/ml，最适终浓度为125μg/ml。

8.根据权利要求7所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：在100毫升转化培养基中添加表面活性剂0.01～1克，所述的表面活性剂为聚乙烯醇、水溶性维生素E、吐温80、吐温20、泊洛沙姆等的任意一种；或采用双水相系统，所述的双水相系统为聚乙二醇2000、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇10000、聚乙二醇35000等分别与磷酸盐组成的双水相系统；聚乙二醇系列与聚乙烯吡咯烷酮组成的双水相系统；聚乙二醇浓度5～20％；磷酸盐浓度为1～3％；聚乙烯吡咯烷酮浓度5～15％。

9.根据权利要求8所述的利用巨大芽孢杆菌制备去甲基雷帕霉素的方法，其特征在于：巨大芽孢杆菌转化雷帕霉素的转化液用乙酸乙酯以1∶1～2体积比萃取2次，每次10～20分钟，将萃取液50～55℃减压浓缩至干后重新用丙酮溶解，去除不溶物，50～55℃减压浓缩至干；从转化液中将3个去甲基雷帕霉素分离开来，用葡聚糖葡聚糖凝胶LH-20为填料进行柱层析，氯仿洗脱；也可用0DSC18反向硅胶为填料进行柱层析，乙腈/水系统洗脱，出峰顺序为29，42-O-双去甲基雷帕霉素、42-O-去甲基雷帕霉素及29-O-去甲基雷帕霉素；通过上述柱层析，收集到的3个去甲基雷帕霉素纯度均可达90％以上；接着，以300～400目硅胶为填料，以丙酮/正己烷为流动相进行柱层析，获得纯度＞98％的3个去甲基雷帕霉素。