[发明专利]RYR1基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及RYR1基因SNP检测 特异性引物、液相芯片和检测方法。

背景技术

理阿诺碱受体1(Ryanodine receptors 1，RYR1)作为一种钙离子通道蛋白，在肌细胞终 未池钙离子释放和促发肌细胞收缩中起着关键性的作用。RYR1突变已被确认为是中央轴空 肌病(central core disease，CCD)、多微小轴空病(multiminicore disease，MmD)、恶性高热 (malignant hyperthermia，MH)及轴空/杆状体病(Core/rod disease，CRD)的主要原因。

自从1993年zhang报道RYR1为CCD的致病基因后，到目前为止，已有44种RYR1突变报道 与CCD相关，包括39个错义突变和5个缺失突变。研究表明，大部分的CCD均由RYR1基因突 变所致。RYR1同样也是MmD的致病基因，但至今仅有数例报道，极为少见。CRD指的是在 轴空病的肌肉病理中，10％以上的肌纤维中同时出现杆状体，近来不同的RYR1基因突变已在 轴空/杆状体病的家系中被确定，这表明杆状体可能是某些CCD的继发性病理改变。而MH是 由挥发性吸入麻醉药和琥珀胆碱所触发的骨骼肌异常高代谢状态，是一种具有家族遗传性的 亚临床肌肉病。RYR1基因多态性是大部分MH发生的分子生物学基础，所以RYR1基因致病 突变型的检测成为必要。

RYR1渗漏通道的突变多位于N端和中央区域(如：Tyr523Ser，Arg2163His，Arg2435Leu)， 而兴奋收缩失藕联的突变多位于C端(如：Gly4890Arg，Arg4892Trp，Ile4897The， Gly4898Glu，Gly4898Arg，Ala4905Val，Arg4913Gly)。然而C端的Ile4795Cys，产生的却是 渗漏通道。

目前，RYR1最常见的突变点为R614C、G2434R和G341R，它们约占恶性高热病例的10％。 其中，R614C和G341R常见于欧洲大陆，G2434R常见于北美洲。日本报道的大多突变为 R1667C、P1773S、Q3756E和P1763S。中国大陆仅有1例恶性高热基因突变报道其突变点为 T2206M。

目前国内外几乎没有检测RYR1基因多态性的产品上市，大部分仍处于实验研究阶段，尚 未商品化，已有的检测技术主要建立在PCR的基础上，如直接测序法，荧光定量PCR，PCR- 单链构象多态性分析(SSCP)检测，这些技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点， 同时，由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应一限制性片段长度多 态(PCR-RFLP)分析技术一次只能进行一种突变的检测，耗时费力。

发明内容

本发明的目的之一是提供RYR1基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测RYR1基 因的正常基因型以及四种常见等位基因型G341R、R614C、T2206M和G2434R的变异。

实现上述目的的技术方案如下：

一种RYR1基因SNP检测液相芯片，主要包括有：

(A).针对RYR1基因的SNP位点分别设计的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和 3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为：针对G341R 位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对R614C位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、 针对T2206M位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14；和/或针对G2434R位点的SEQ ID NO.15 及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1-8中的序列；

(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag 序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所 选的tag序列互补配对；

(C).用于分别扩增具有G341R、R614C、T2206M、和/或G2434R SNP位点的RYR1基因目标 序列的扩增引物。