[发明专利]番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与基因工程领域，尤其涉及一种番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。本发明涉及番茄SlGRX1的cDNA序列，该cDNA编码的蛋白属于CFGS类谷氧还蛋白。

背景技术

活性氧是植物生长发育过程中重要的信号传导因子，对促进植物的生长发育和新陈代谢，以及作物的高产、优质都起着重要的作用。然而，植物体内过多的活性氧积累会对破坏其体内的生物大分子，干扰植物正常的信号传导进而对植物造成严重的伤害，容易造成植物的萎蔫甚至死亡。植物生长的各种逆境环境如干旱、盐害、冷害、重金属、紫外辐射、臭氧、机械伤害、营养缺乏、病原体入侵、高光强等均导致光合电子传递链及呼吸链产生过量活性氧，严重影响植物的生长发育，从而降低植物的产量与品质。

为了抵抗环境的活性氧胁迫，植物在长期的进化的过程中形成了清除活性氧的复杂基因调控网络，包括mRNA的降解与选择性剪切、蛋白质的磷酸化与去磷酸化、糖基化、泛素化等。其中谷氧还蛋白基因在植物的抗氧化胁迫中起重要作用，该类蛋白其能够还原生物体内蛋白质间或者蛋白质内部的二硫键而形成巯基，维持蛋白的氧化还原状态，从而调控蛋白的活性。近年来，蛋白质的可逆氧化还原修饰日益受到重视，这种修饰可能是信号转导调控中的一种新的分子机制，成为除磷酸化修饰、糖基化修饰及泛素化修饰外的重要方式。通过获得新的谷氧还蛋白基因，研究其分子功能，对于研究植物抗逆的分子机理有重要价值，也为植物的基因工程研究提供新的基因资源。

发明内容

本发明的目的是针对目前对植物抗逆反应分子机制、抗逆植物基因资源匮乏等问题，提供一种番茄谷氧还蛋白基因SlGRX1及其克隆方法和用途。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1是具有如SEQ ID NO：1所示1003个碱基DNA序列，编码具有抗氧化、干旱及盐碱能力的CGFS类的谷氧还蛋白。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1的克隆方法包括下列步骤：

1)根据拟南芥和水稻的CGFS类谷氧还蛋白基因，对其进行多序列比对，根据保守的同源序列设计了一对简并引物，上游引物T1为5’-SAAAGTGGTTCTSTWYATGAARGG-3’，下游引物T2为5’-ATATCWSAACCACCGAMMARYTC-3’，其中，W代表T或者A，S代表G或者C，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，N代表A或者C或者G或者T，M代表A或者C，R代表A或者G，Y代表C或者T，D代表A或者G或者T；

2)用上述引物经RT-PCR扩增基因片段，经测序后与NCBI等网上数据库进行同源性比对，证明得到的片段为为番茄的谷氧还蛋白基因的片段；

3)以上述扩增的基因片段为种子序列，采用电子克隆的方法，在番茄的EST数据库中进行电子延伸拼接，根据延伸的序列设计引物，上游引物YGS2为5’-CATGGCGACCTTCAACATCTC-3’，下游引物YGAS为5’-AATGAATTTTCTTCAAACTATTGC-3’，利用RT-PCR克隆获得到1003bp的基因片段，将该片段克隆到PGEM-T easy载体上测序，得到的基因命名为SlGRX1；

番茄CGFS类蛋白是具有权利要求1所述植物谷氧还蛋白基因SlGRX1编码的如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者与其氨基酸序列至少60％同源性。

植物谷氧还蛋白基因SlGRX1用于经转基因或杂交育种改良植物的抗氧化、干旱及盐碱的能力。

本发明与现有技术相比具有的优点：

1)采用同源克隆及电子克隆的方法从番茄中克隆到一个新的谷氧还蛋白基因，克隆方法简单、高效。

2)通过利用基因的下调和上调表达2种方法分析基因的功能，数据更为确凿可信，通过2种方法均证明该基因具有抗氧化、干旱及盐碱的功能，具有很强的理论研究及应用研究价值。可以通过外源基因导入技术过量表达SlGRX1基因来提高植物对氧化、干旱及盐碱的能力，从而增强作物对逆境的抗性，提高作物的产量与品质。

附图说明

图1是SlGRX1基因的组织表达特异性；

图2是SlGRX1蛋白的亚细胞定位；

图3是SlGRX1基因沉默番茄与对照植株对氧化胁迫的反应。A：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶盘在H₂O₂胁迫下0d和5d时的症状表现；B：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株叶盘的相对叶绿素含量随时间变化；C：SlGRX1基因沉默番茄与对照植株中SlGRX1基因的表达情况；