[发明专利]一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用

权利要求书

1.重组抗菌肽PMAP-36的工程菌以及产物的制备方法，其特征在于其操作步骤为：

A.PMAP-36基因的获得和扩增：参照LS(Invitrogen)试剂盒说明书，从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。在人工合成引物的存在下，通过RT-PCR获得编码PMAP-36的基因片段。

B.基因克隆和转化大肠杆菌：回收PCR产物，用T4连接酶与PMD18-T载体连接。转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经抗性培养基筛选后，获得具有正确编码序列的PMAP-36基因。

C.酿酒酵母表达载体构建和转化：分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/α。回收酶切产物，用T₄DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PVT-PMAP36，用电转的方法转入酿酒酵母S78，获得阳性转化子S78-PMAP36。

D.将工程菌扩大培养，纯化蛋白：

2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于步骤A中，在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点，在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为：

S1：5′-CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3′

F1：5′-GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3′

3.如权利要求1所述，其特征在于步骤B中的抗性培养基含有氨苄青霉素。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于在酵母表达载体的多克隆位点间插入抗菌肽PMAP-36基因，其表达框为ADH1-MFα-抗菌肽PMAP-36-TT，其中ADH1为启动子，α是α因子信号肽序列，TT是终止子。

5.如权利要求1所述，其特征在于步骤C中电转的步骤为：将80μl酵母细胞感受态细胞与5～10μl重组质粒PVT-PMAP36混合均匀，转入到冰预冷的0.2cm电转槽中，将混合液在冰上放置5min；1500V，5ms电击，然后加入1ml恢复培养液，于30℃培养箱中培养2h；将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中，30℃培养至单菌落出现。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D中工程菌的纯化，具体步骤为：挑取高效阳性转化子S78-PMAP36，在YPD(1％酵母抽提物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)液体培养基中扩大培养，当OD₆₀₀＝2-6时，收集菌液，离心取上清。用CM-cellulose23柱层析，收集蛋白组分，冷冻干燥，获得重组PMAP36蛋白。

7.权利要求4～6任选一项的方法在生产制备抗菌肽饲料添加剂、食品保鲜、农作物病害防治以及医药产品中的应用。