[发明专利]一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用

说明书

【技术领域】

本发明属于生物基因工程技术领域，具体地说涉及一种重组抗菌肽，其基因工程菌制备方法及应用。

【背景技术】

目前，抗菌肽(antimicrobial/antibacterial peptides，AMP/ABP)已成为免疫学和分子生物学研究的热点。抗菌肽是一类具有抗菌活性的阳离子短肽的总称，是生物先天性免疫的重要组成部分，广泛存在于各种细菌，植物，动物以及人体中。抗菌肽具有高效，广谱抗微生物的活性特点，使其对革兰氏阳性，阴性细菌存在较强的杀伤作用，此外还具有杀真菌，原虫，抗病毒活性，杀伤肿瘤细胞等特点。

近年来，由于人类对抗生素的过度滥用，药物残留和细菌耐药性等问题日益严重，不断困扰着畜牧养殖业并引发食品安全问题。抗菌肽这一非专一性免疫应答产物，对于外界各种病原体均可产生免疫应答，而不存在某一特定的抗原物质，也不易导致病原菌产生耐药性。因此抗菌肽的问世推动了新型抗菌药物的开发研制。

目前已经从猪体内发现了12种以上不同的抗菌肽，这些抗菌肽具有不同的螺旋结构，分子量相对较小(小于10kDa)，但对多种微生物有广谱杀灭作用。根据抗菌肽前体的基因结构、氨基酸序列特征，可将猪源抗菌肽分为4类：防御素(Defensins)超家族、Cathelicidins家族、Cecropins家族和NK-lysin。Cathelicidins和防御素是到目前为止在哺乳动物中所发现的两个最大群体的抗菌肽家族。

20世纪90年代，在进行bactenecin5cDNA克隆时发现Cathelicidins与抗菌肽具有共同的结构特征，即N末端都含有一个Cathelin区域，所以在1995年将其命名为Cathelicidins。研究证明编码Cathelicidins基因有4个外显子和3个内含子。前体区含有123～144个氨基酸残基，包括一个29～30个残基的信号肽和一个长约94～144个氨基酸残基的Cathelin前段。C末端区域含有长12～97个氨基酸残基的成熟肽段。前体区具有高度的同源性，猪种内同源性达100％。Cathelin前段的C端区域有4个固定的半胱氨酸，形成2个二硫键。这些基因的5′端旁侧序列含有几个调控模体，包括参与炎症反应和急性期应答的核因子(nuclear factor，NF)，如核因子白介素-6(NF-interleukin-6)、核因子KB(NF-KB)、白介素-6应答元素(interleukin-6 response element)、急性期应答因子(acute phase-response factor，APRF)和γ干扰素应答元素(γ-interferon response elements，γIRE)的位点。Cathelicidins以前肽原的形式存在，其N端为信号肽，C端是带阳离子的成熟肽段，另有带阴离子的Cathelin前段，可能用于中和阳离子肽段，使它在胞内运输、贮存时保持无活性的前肽状态，以避免细胞毒性。在多数情况下，这些抗菌肽的Cathelin区域被蛋白水解酶水解，释放出一级结构高度不同的阳离子抗菌肽。尽管Cathelicidins前肽原确切功能还不清楚，但研究者揣测这些分子有特异的生物学功能，而不仅仅是抗菌肽的贮存形式。

目前，已经至少从8种哺乳动物包括猪、水牛、兔等体内发现了30多种Cathelicidins。猪的Cathelicidins家族包括PR-39、Protegrins1～5、PMAP-23，36，37。它们都起源于骨髓细胞，组成性的以前肽(Propeptides)形式储存在周边PMNs(中性粒细胞)颗粒中。当PMNs激活和脱颗粒时，内源性弹性蛋白酶把成熟肽从前肽中切割出来。在一些情况下，这些肽通过C端酰胺化进一步修饰。

PMAP-36(porcine myloid antimicrobial peptide，PMAP)属于猪髓源性抗菌肽，对其结构预测和圆二色谱分析表明PMAP-36具有两亲性α螺旋结构。体外试验表明合成的抗菌肽具有很强的抗菌活性。PMAP-36的杀菌活性为10～50μmol/l且高于100μmol/l时也未发现溶解红细胞的作用。

由于从天然来源制备PMAP-36低效耗时，纯化抗菌肽产量极低，且费时费力，分离纯化困难，从而导致生产成本过高，不便于大规模生产使用。而化学合成抗菌肽成本高，且制备过程中常需要添加毒性有机物，不能满足安全、绿色饲料添加剂的生产要求。本发明采用分子生物学与基因工程的手段来克服上述难题，研制开发高效的重组抗菌肽。

【发明内容】