[发明专利]克隆鳞翅目昆虫雄性基因组的方法

说明书

技术领域

本发明属于昆虫生物工程领域，具体涉及一种克隆鳞翅目昆虫雄性基因组的方法。

背景技术

克隆(clone)一词的生物学含义，作为名词指无性繁殖系，作为动词指进行无性繁殖的过程。克隆作为名词有克隆生物、克隆细胞和克隆基因三个层次的含义。克隆生物是指一个多细胞生物遗传上与另外一个(群)生物一样；克隆细胞是指由同一个祖先细胞分裂繁殖而形成的纯细胞系；克隆基因是指生物的某个基因(或片段)复制产物。克隆技术是一种在生命科学领域的普遍使用的研究和应用技术，最主要的用途是生殖性克隆产生后代生物体和研究性克隆或医学性克隆产生研究所用的克隆组织或克隆细胞，尤其在动物优良物种和实验动物培育、转基因动物生产、动物资源保护、生产人和动物干细胞用于细胞和组织替代治疗等方面具有广阔的发展前景。

自然克隆生物是指由无性生殖产生的遗传上完全一样的生物，植物无性繁殖和某些原生动物的分裂繁殖、尾索类动物的出芽生殖等是常见的自然克隆生物。包括哺乳动物在内的高等动物一般很少出现自然克隆个体，只见于偶然原因产生的同卵双胞胎或同卵多胞胎。通常所说的克隆动物是指人类通过遗传工程方法复制动物，目前普遍使用的方法是首先将一个成熟卵细胞的细胞核取出，随后将一个待繁殖细胞的细胞核植入该去核卵细胞内，进一步对核移植细胞进行基因组活化刺激，并进行精核与卵细胞质的融合处理，使其分裂、发育，从而发育为成体。这种“细胞核移转方式”的克隆技术，虽然其操作原理简单，推广普及方便，但由于细胞核移植、基因组活化刺激、以及精核与卵细胞质的融合处理等过程的损伤，克隆后代的畸变率很高。另一方面，人工克隆系克隆后代与亲代的一致性显著低于自然无性生殖系，存在许多未知的和生物安全性不可预测的基因、形态和功能的变化，这种变化对医学性克隆的应用与发展也有很大的影响。

鳞翅目昆虫是体内授精、体外受精卵生昆虫，由于卵壳坚硬、不透明，以及卵细胞核很小等原因，目前还没有细胞核移转方式的克隆技术存在。

家蚕，也称桑蚕，学名Bombyx mori Linnaeus，是国际无脊椎动物协会确定的鳞翅目模式昆虫。目前在鳞翅目昆虫中，只有家蚕具有雄核发育技术，但这种方法只能获得在家蚕卵内发育的家蚕雄核发育个体。

发明内容

本发明目的是提供一种克隆鳞翅目昆虫雄性基因组的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种克隆鳞翅目昆虫雄性基因组的方法，包括以下步骤：

(1)根据所用受体昆虫和供体昆虫的生物学特性，在适宜生长发育温度范围内，调节饲养开始时间和饲养及保护温度，促使供体昆虫雌雄蛾在受体昆虫雌蛾羽化前2日至羽化当日羽化(保证在受体昆虫雌蛾羽化前2日至羽化当日有羽化的供体昆虫雌雄蛾)；在受体昆虫雌蛹羽化前的2d～3d接受辐射，破坏卵母细胞核；

(2)采用供体昆虫雄蛾的精液对受体昆虫处女蛾进行人工授精；

(3)选择适合受体昆虫生物学特性的产卵温度和相对湿度，收集步骤(2)中人工授精处理后的雌蛾的产出卵；

(4)对步骤(3)所得产出卵进行雄核发育处理，获得雄核发育昆虫卵；

(5)按常规现有技术筛选和处理步骤(4)所得雄核发育昆虫卵，选择适合受体昆虫生物学特性的卵孵化温度、相对湿度和光照条件，进行孵化处理，实现对鳞翅目昆虫雄性基因组的克隆，即获得精子供体昆虫的G1代雄性基因组克隆体。

上述技术方案中，所述受体昆虫和供体昆虫包括：鳞翅目蚕蛾科昆虫家蚕(Bombyx mori Linnaeus)和野桑蚕(Bombyx mandarina L.)、鳞翅目大蚕蛾科昆虫蓖麻蚕(Philosamia cynthiaricini Boisduval)、鳞翅目天蚕蛾科昆虫柞蚕(Anfheraea pernyi Guerin-Meneville)、鳞翅目夜蛾科昆虫斜纹夜蛾(Spodoptera litura)。

上述技术方案中，步骤(1)中为促使供体昆虫雌雄蛾同日羽化，如果雄蛾比雌蛾提前羽化情况下，可以使用10℃～5℃冷藏早羽化的雄蛾，3d内与羽化的新鲜雌蛾交配。

上述技术方案中，步骤(2)中获得供体昆虫雄蛾的精液的方法为现有技术，可采取以下两种方法中的任一种：

方法一：20℃～30℃环境温度下，精子供体的雄虫与同种昆虫雌虫交配10min～40min，待成虫储精囊中精子转移至雌虫体内交配囊中，无菌条件下解剖获得雌蛾交配囊，无菌生理盐水洗涤3次。

方法二：在无菌条件下，解剖精子供体雄虫的储精囊，无菌生理盐水洗涤3次。