[发明专利]携带修饰物的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种携带修饰物的核苷酸及其制备方法和用于基因测序的方法。

背景技术

在传统的基因测序技术中，采用的是双脱氧链终止法(Sanger)。加入核苷酸到反应体系中进行DNA合成反应，核苷酸上的碱基逐步结合到DNA待测模板的不同位点，在一次合成结束时，由于每个碱基停止的位置不同，导致生成的各段DNA双链长短不一，则利用电泳将其分开，然后标记ATCG，根据不同的停止位点测定各碱基。

目前采用的一种测序方法是：首先将模板与引物杂交；然后加入DNA聚合酶和修饰过的核苷酸，该核苷酸的3端-OH连接有荧光标记物(Fluorophore)，DNA聚合反应时该荧光标记物可使反应暂停；反应暂停时测定此处的碱基；最后去除3’端的荧光标记物，使DNA聚合反应继续。由上可知，该方法采用将荧光标记物堵住核苷酸的3端-OH的方式来达到暂停的目的，但是在后续去除荧光标记物时必须切除-OH，数次反应之后将无法彻底切除荧光标记物，这样会导致反应无法继续进行，就不能测得更长的基因序列。

目前采用的另一种测序方法，是基于焦磷酸的测序方法。测序合成反应是基于常规的合成方法，而信号检测是通过对于焦磷酸的释放过程的ppi的检查，通过酶将ppi转化为光信号进行检测。这种测序法是一种实时合成测序法，测序反应中间并无暂停步骤。这种方法的最大弱点是同聚物序列的检测不准确，同样的多个连续碱基的测量因为光信号的线性度不准而测量不准。

因此需要一种新的基因测序方法，能解决测序准确率低和测序长度较短的问题。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种携带修饰物的核苷酸，旨在解决现有技术测序准确率低和测序长度较短的问题。

为了实现发明目的，所述携带修饰物的核苷酸的结构通式如下：dNTP-R；式中dNTP为核苷酸，修饰物-R连接在核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置，其包含至少一个可切除位点、至少一个标记物。

优选地，，-R的结构为：-R1-R2；其中，-R1为第一修饰物，连接在碱基上；-R2是第二修饰物，包含一个可切除位点、一个标记物。

优选地，所述第一修饰物-R1携带氨基末端，第二修饰物-R2携带醛基末端，两者以酯键结合成为所述修饰物-R。

优选地，所述第一修饰物-R1的结构是长度为n的碳链并结合氨基末端，即：-CnHm-NH-，其中n、m均为正整数。

优选地，所述第二修饰物-R2的结构为：-R21-R22；其中，-R21是可切除位点；-R22是标记物。

优选地，所述可切除位点-R21的结构由双硫键构成，即：-S-S-，可通过还原剂打开。

优选地，所述可切除位点-R21为吡喃醇结构，即：

可在其6h位置的C-O键打开。

优选地，所述标记物-R22包括荧光标记物，或生物素标记物。

优选地，核苷酸dNTP包括：dATP、dGTP、dCTP、dUTP。

本发明的目的之一在于提供一种携带修饰物的核苷酸的制备方法，旨在解决现有技术测序准确率低和测序长度较短的问题。

为了实现发明目的，所述携带修饰物的核苷酸的制备方法包括：

将脱氧核糖上-OH以外的位置连有第一修饰物-R₁的核苷酸，与带有可切除位点的第二修饰物-R₂进行反应，结合成为携带修饰物的核苷酸dNTP-R。

优选地，上述制备方法包括：A.将第一修饰物-R₁连接到核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置，生成dNTP-R₁；B.对标记物进行修饰，生成带有一可切除位点的第二修饰物-R₂；C.将连有第一修饰物的核苷酸dNTP-R₁与第二修饰物-R₂结合，生成所述携带修饰物的核苷酸dNTP-R；其中，所述步骤A和B无先后顺序。

优选地，上述制备方法包括：A1.将携带氨基末端的第一修饰物-R₁连接到核苷酸中除脱氧核糖上-OH以外的位置；B1.对标记物进行修饰，生成带有一可切除位点及醛基末端的第二修饰物-R₂；C1.将步骤A1中携带氨基末端的核苷酸，与携带醛基末端的第二修饰物-R₂进行反应，以酯键结合，生成所述携带修饰物的核苷酸；其中，所述步骤A1和B1无先后顺序。