[发明专利]人乳头瘤病毒类病毒颗粒的制备方法和外源蛋白表达盒、表达系统

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，更具体地说，本发明涉及一种人乳头瘤病毒类病毒颗粒的制备方法、以及一种外源蛋白表达盒、一种双缺陷型甲醇酵母菌表达系统。 

背景技术

宫颈癌是危及全球妇女健康的重要疾病，发病率位居女性肿瘤第2位。全世界每年约有470000例宫颈癌患者被诊断出来。美国癌症中心2007年调查结果显示，全世界新增病例555100例，死亡309800例。生殖道HPV(Human Papillomavirus，人乳头瘤病毒)感染是一种常见的性传播疾病，在美国大约有2千万人随时被干扰，也能随时传给他人，政府每年都要花费约60亿美元对全国人口进行尖锐湿疣的诊断筛选和治疗工作。我国每年新发宫颈癌病例约140000，约占全球宫颈癌新发病例的28.8％，且发病年龄有年轻化的趋势。高发地区为山西、甘肃、陕西、湖南等地，农村女性占较高比例。 

临床试验、分子生物学研究和病原学研究表明，99.7％以上的宫颈癌活检标本中可检测到人乳头瘤病毒，人乳头瘤病毒感染是宫颈癌和尖锐湿疣发病的主要因素，这一重大发现获得了2008年度诺贝尔生理学、医学奖。HPV的发现使宫颈癌成为迄今病因最明确的一种癌症，同时也给宫颈癌的早期预防和筛查以及宫颈癌疫苗的研发打下了基础。高危型HPV与肿瘤的启动、发生、发展及恶性表型的全过程都密切相关，是与人类肿瘤关系最为密切的肿瘤病毒。由于HPV具有严格的种属和组织限制性，难以建立相应的动物模型及通过体外培养获得病毒颗粒，因此应用基因工程技术表达HPV蛋白是宫颈癌疫 苗研究的方向。 

人乳头瘤病毒是一类双链小分子DNA病毒，直径约为55-60nm，约8kb，呈无包膜20面体对称核衣壳结构，表面有72个壳粒，每个壳粒包含5个L1蛋白，L2蛋白的数量和确切位置尚不清楚，可能与20面体的顶部结构有关。HPV主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。HPV具有严格的种属特异性，因此目前疫苗研究主要集中在基因工程生产HPV亚单位疫苗。类病毒颗粒是HPV疫苗研发及抗原检测首选的目的蛋白，天然的HPV类病毒颗粒由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约10∶1，单独的L1蛋白可自行包装与成熟病毒大小相近的类病毒颗粒(Rose RC et al.，J virol1993，67(4)：1936-44)，具有与病毒颗粒同样的形态结构及免疫原性。只有装配成类病毒颗粒，才能诱发中和抗体，使机体产生预防病毒侵染的能力(Suzich，J A et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1995 Dec5；92(95)：11553-7)。已有两种由L1构成的VLP预防性疫苗上市，Merck公司的四价疫苗“Gardasil”及GSK公司的二价疫苗“Cervarix”，分别用酿酒酵母和昆虫细胞表达，两种疫苗安全性良好，对于预防HPV 6、11、16和18相关的持续性感染及相关的高度宫颈病变方面非常有效。但L1肽段的变异性较高，无法产生交叉免疫性，这两种疫苗只能有效地抑制少数高危型HPV，并不能完全保护机体免受其他宫颈癌HPV型别的感染。另一方面，由于其价格和温度限定等因素极大的限制了该疫苗在宫颈癌高发的发展中国家的使用。目前，第二代HPV疫苗研发的重点是以L1和L2蛋白共同包装的类病毒颗粒为基础。这种两种蛋白共同包装的类病毒颗粒在尺寸和形态上更接近天然构象，因此更加稳定并且提高了蛋白表达的效果(Ramon P et al.，Arch virol 2009154：187-197)。L2蛋白虽然免疫原性较弱，但在HPV各亚型中具有高度的保守性，可以发生交叉反应，为HPV疫苗的研究提供了一条新思路(Ratish G et al.，J virol 2007 Dec81(24)：13927-931)。与现有疫苗相比，这种疫苗的优势在于将保留天然病毒构象中尽可能多的表位，能够产生针对更多型别，更广泛的中和抗体，同时更高效率的表达及更简化的制备方法，以降低价格提高 稳定性。因此，本发明应用双缺陷型酵母表达系统在同一宿主菌种表达L1和L2蛋白，并在体内使其自行装配成类病毒颗粒，力图实现该疫苗生产的高效低成本。这种由L1和L2蛋白在真核细胞大量表达，并自发组装成的病毒样颗粒是目前公认的最具前景的HPV疫苗。