[发明专利]4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化及分离纯化方法

权利要求书

1.一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：

(1)、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(2)、将步骤(1)所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4′-去甲基表鬼臼毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的腐殖性土壤菌从湖北恩施或神农架等地的土壤中分离得到；优选的，所述的腐殖性土壤菌是藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)SH-f13，其微生物保藏号是CCTCC NO：M2010038；

所述的鬼臼类植物内生菌从八角莲属(Dysosma)、桃儿七属(podophyllum)、山荷叶(Diphylleia)或沙地柏(Sabina vulgaris Ant)中分离得到；优选的，所述的鬼臼类植物内生菌是细交链格孢(Alternaria alternata)S-f6，其微生物保藏号是CCTCC NO：M 2010037。

3.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：所述的生物转化包括摇瓶级或生物反应器规模的生物转化；其中，步骤(1)或步骤(2)中所述的生物转化温度为15-40℃，优选为30℃；当采用摇瓶进行发酵时，所述的摇床转速为50-300转/分钟，优选的，所述的摇床转速为150转/分钟。

4.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：步骤(1)中将鬼臼毒素作为底物加入到发酵培养基时，所加入用量为至终浓度0.01-5克/升，优选为0.2克/升；步骤(2)中在发酵培养基中添加川芎嗪至其终浓度为0.01-5克/升，优选为0.1克/升。

5.按照权利要求1所述生物的方法，其特征在于：步骤(1)中或步骤(2)中所述的液体发酵培养基组成是：酵母膏1-100克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升、pH值2-9；优选的，所述的液体发酵培养基的组成是：酵母膏3克/升，硫酸镁0.5克/升、磷酸氢二钾1克/升、pH值为7；

所述的腐殖性土壤菌二级液体种子或鬼臼类植物内生菌二级液体种子的制备包括以下步骤：(1)培养斜面菌种；(2)培养一级液体种子；(3)培养二级液体种子；

其中，培养斜面菌种中所用到的培养基和培养条件为：

培养基：葡萄糖10-500克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸二氢钾1-40克/升、盐酸硫胺0.05-10克/升、琼脂20克/升、马铃薯提取液1.0升；

培养条件：培养温度为15-40℃；

培养一级液体种子所用到的培养基和培养条件为：

培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟；

培养二级液体种子所用到的培养基和培养条件为：

培养基：葡萄糖10-500克/升、酵母膏1-100克/升、硝酸钠1-50克/升、硫酸镁0.5-40克/升、磷酸氢二钾1-40克/升、硫酸亚铁0.01-10克/升、氯化钾0.5-40克/升；pH值2-9；

培养条件：培养温度15-40℃，摇床转速为50-300转/分钟。