[发明专利]4-(2,3,5,6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化及分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鬼臼类化合物的制备方法，尤其涉及4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法，本发明还涉及该4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的分离纯化方法以及含量检测方法，属于鬼臼类化合物的生物转化领域。

背景技术

4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素是一种鬼臼类化合物(又名4-(2，3，5，6-tetramethylpyrazine-1)-4’-demethylepipodophyllotoxine)，其结构式为图(I)所示。

                  (I)

对鬼臼毒素的C环4位，以β碳氮键芳环取代作为修饰方向所得到的衍生物普遍具有良好的抗肿瘤活性和生物利用度，这已被众多文献或专利报道(Bioorgan MedChem 2005；13(22)：6218-6225，Anticancer Res，2006，26(3A)：2149-2156，US-07/987,765)。尽管4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素是否具有体内抗肿瘤作用目前还不能确定，但申请人其对体外肿瘤细胞毒性的前期研究表明，4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素对KB等肿瘤细胞生长具有良好的抑制作用，因此作为一种抗肿瘤化合物，具有药物开发的潜在价值。

目前针对鬼臼类衍生物的结构修饰研究，以化学合成方法为主。然而，随着人类需求的日益增长，化学合成法已显出较大弊端：一是规模小、产量低；二是化学残留难以除去，三是生产成本高。上述这些因素必将导致4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的价格高昂，因此寻找一种适合大规模工业化生产4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，成为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素研发的重中之重。

基于生物转化技术具有反应条件温和、E-factor低、质量可控、分离过程简单等优点，越来越多的学者倡导以生物转化技术为代表的绿色制药过程(Curr Opin ChemBiol 2009；13：43-50)。研究证明利用生物转化对鬼臼毒素进行分子结构修饰具有可行性，如：果德安教授(J Aslan Nat Prod Res 1998；1(2)：99-120)利用掌叶大黄细胞和青霉菌转化鬼臼毒素，使鬼臼毒素D环的反式结构转化为顺式结构，得到鬼臼苦素；英国诺丁汉大学Broomhead等(Phytochemistry 1991；30(5)：1511-1517)发现美国金钟连翘悬浮培养细胞具有将鬼臼毒素氧化为鬼臼毒酮的能力，同时产生少量的鬼臼苦酮。澳大利亚墨尔本大学Teng等(Biocataly Biotransfor 2007；25(7)：1-8)以大麦悬浮培养细胞转化鬼臼毒素得到异鬼臼苦酮。

综上所述，开发研究出一种廉价易行的生产4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明首先所要解决的第一个技术问题是提供一种将鬼臼毒素转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的生物转化方法，该方法切实可行、操作简单、质量可控、成本低、易规模化工业生产，能够根据需要很好地解决4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素生产用于不同规模、不同研究领域等一系列问题。

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种将鬼臼毒素生物转化为4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的方法，包括：

(1)、将鬼臼毒素加入到液体发酵培养基中，然后接种腐殖性土壤菌二级液体种子进行生物转化，得到含有4′-去甲基表鬼臼毒素的生物转化产物；(2)、将步骤(1)所得到生物转化产物经分离纯化后加入到液体发酵培养基中，然后接种鬼臼类植物内生菌二级液体种子进行生物转化，将4′-去甲基表鬼臼毒素转化为4′-去甲基表鬼臼毒酮；随后在液体发酵培养基中添加川芎嗪继续进行生物转化，得到含有4-(2，3，5，6-四甲基吡嗪-1-基)-4′-去甲表鬼臼毒素的发酵液或菌丝体。