[发明专利]基于荧光共振能量转移的多组分同时检测的均相免疫分析方法

说明书

技术领域：本发明属于荧光免疫分析技术领域。

背景技术：免疫分析法是一种微量生物分析方法，它利用抗原抗体间的高亲和性以及 作为探针的标记物的高度可测性，能够对生物体内微量物质进行准确的定量分析，具有操作 简单、特异性好、灵敏度高等优点，已成为生物学、医学、化学等学科领域研究的重要手段。 免疫分析法根据其标记物的不同可分为放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、 荧光免疫分析法(FIA)和化学发光免疫分析法(CLIA)等。RIA灵敏度高但存在放射性污染，已 逐渐退出市场。ELISA是目前国内外应用最为广泛的免疫分析方法，但灵敏度较低，一般仅 用于定性或半定量分析。CLIA是上个世纪90年代发展起来的一种新的免疫分析方法，但成 本较高，且灵敏度并未达到RIA的水平，目前并未广泛应用。常规荧光免疫分析法(FIA)因无 放射性、无酶试剂的不稳定性及效期限制，在超微量免疫分析领域引起人们更大的关注。在 FIA领域中，最重要的改进之一是发展了时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，具有灵敏度高、 线性范围宽等优点。

免疫分析根据其反应系统的物理状态的不同可以分为均相免疫分析和非均相免疫分 析。在现有的免疫分析方法中，非均相免疫分析法以RIA、ELISA和CLIA应用最为广泛， 但非均相免疫分析需要进行抗原抗体复合物与游离抗原抗体的分离步骤，从而提高信噪比和 分析的灵敏度，所以操作相对繁琐。分离抗原抗体复合物与游离抗原抗体是关键，也最容易 产生误差。而且由于非均相免疫分析包括了包被(抗原或抗体)、封闭、多次温育、洗涤以及 检测等过程，一般需要2小时以上。均相免疫分析因其具有不需要分离抗原抗体复合物与游 离抗原抗体即可直接以及均相反应比固相、半固相反应更为简便迅速等特点，成为目前免疫 分析方法研究中的重要方向。其中均相荧光免疫分析在抗原抗体特性性反应完成之后，无需 将抗原抗体复合物与游离的抗原抗体进行分离，可以直接进行测定，操作简单快捷，易于实 现自动化，得到了广泛应用。

荧光共振能量转移(FRET)是一种非辐射的能量转移，其产生需满足以下4个条件：

1)能量供体的发射光谱与能量受体的激发光谱有效重叠；

2)能量供体的量子产率较高；

3)供体受体间满足一定的耦极取向；

4)供体受体间的距离小于10nm。

供体与受体之间发生FRET将会使能量供体的荧光强度降低，受体发射的荧光强度增 强，同时伴随它们的荧光寿命的相应缩短和延长。FRET技术作为一种高效的光学“分子尺”， 在于生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。

FRET属于一种比较简便的均相免疫分析法，由于其操作简单，反应速度较快，越来越 引起人们的关注。

以FRET为基础的均相免疫分析法可分为夹心法和竞争法。

夹心法就是能量转移的供体和受体分别标记同一个抗原相结合的两种抗体，形成 D-Ab1:Ag:Ab2-A形式的抗原抗体复合物，使供体和受体之间的距离减小，发生FRET，从而 可以判断免疫反应的发生。

竞争法就是能量转移的供体和受体分别标记抗原和抗体中的一种。由于抗原、抗体之 间的特异性结合，使供体和受体之间发生能量转移，当加入未标记的抗原或抗体时，由于与 标记的抗原或抗体发生竞争，产生无FRET现象的抗原抗体复合物，从而可以检测抗原或抗 体。基于荧光共振能量转移的均相免疫分析方法是由1976年Ullman等人首先提出的，实现 了抗原抗体的均相免疫分析的定量测定(Ullman E F，Schwarzberg M， Rubenstein K E.J Biol Chem，1976，251(14)：4172-4178)。

目前基于荧光共振能量转移的均相免疫测定已应用于检测抗原。Ueda等(UedaH， Kubota K，Wang Y，et al.Biotechniques，1999，27(4)：738-742)用琥珀酰亚胺脂和荧光黄-X 分别标记抗体的重链和轻链，两者在比色杯中混合后再加入抗原，抗原抗体的特异结合，使 琥珀酰亚胺脂与荧光黄-X靠近，用490nm波长激发琥珀酰亚胺脂，检测到520nm发射光减 弱，605nm的发射光增强，随着抗原量的增加，605nm的荧光亦增强。在检测中只能对一种 抗原进行定量分析。