[发明专利]慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA，其特征在于：所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA含有pIRES质粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分别位于pIRES质粒上的IRES元件两侧的多克隆位点上；

所述BCR/ABL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述SEA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将BCR/ABL基因插入pIRES质粒的多克隆位点A或多克隆位点B中，得到BCR/ABL-pIRES质粒；

(2)将SEA基因插入BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点中，SEA基因与BCR/ABL基因分别位于IRES元件的两侧，得到慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)提取白血病细胞株K562细胞的RNA通过逆转录合成cDNA；将得到的cDNA为模板，通过引物B1和B2进行PCR扩增，得到长度为354bp的BCR/ABL片段；

所述的引物B1：5’-ATTATGGGGCTCTATGGGTTTCTG-3’；

所述的引物B2：5’-GCCCTAGATGTAGTTGCTTGGGAC-3’；

所述的BCR/ABL片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

方框内所述的CTCGAG为XhoI酶切位点；

方框内所述的GAATTC为EcoRI酶切位点；

(2)以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，通过引物S1和S2进行PCR扩增，得到长度为827bp的SEA片段；

所述的引物S1：5’-GCAATTATGCTTTAGAGGTGAG-3’；

所述的引物S2：5’-CGTCAACTACCATGTTTAACTTG-3’；

所述SEA片段的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

方框内所述的TCTAGA为XbaI酶切位点；

方框内所述的GTCGAC为SalI酶切位点；

(3)用XhoI酶和EcoRI酶分别将pIRES质粒和步骤(1)所述的BCR/ABL片段进行双酶切，再通过T4DNA连接酶将双酶切后的BCR/ABL片段和pIRES质粒进行连接，BCR/ABL片段插入至pIRES质粒的多克隆位点A中，得到BCR/ABL-pIRES质粒；

(4)用XbaI酶和SalI酶分别将步骤(2)得到的SEA片段和步骤(3)得到的BCR/ABL-pIRES质粒进行双酶切，然后通过T4DNA连接酶将双酶切后的SEA片段和BCR/ABL-pIRES质粒进行连接，SEA片段插入到BCR/ABL-pIRES质粒的多克隆位点B中，得到慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述PCR扩增的反应条件为：预变性94℃30sec，退火60℃30sec；延伸72℃30sec，共进行30个循环；首次预变性为94℃4min，末次延伸为72℃10min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述PCR扩增的反应条件为：首先94℃预变性4min，然后94℃1min，50℃1min，72℃1min循环30次，最后72℃总延伸10min。

6.权利要求1所述慢性粒细胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的基因药物。