[发明专利]一种PIK3CA基因突变检测液相芯片

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及PIK3CA基因突变检测液相芯片。

背景技术

PI3Ks(phosphatidylinositol3-kinases)是一组蛋白的多聚体，这些多聚体分为三类(ClassI、II和III)。I类(Class I)蛋白可包括两个亚单位：IA和IB。IA是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异源二聚体。PIK3CA基因是编码IA类的p110α催化亚单位。PI3Ks可由生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)激活。PI3K的活化可产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等方面。

PIK3CA点突变的位点在多个外显子中都有发现，但主要是发生在“激酶”和“螺旋”两个结构域(the kinase and helical domains)。其中最常见的突变是外显子9(Exon 9)的E542K和E545K，和外显子20(Exon 20)的H1047R，如下表：

目前，已经建立的PIK3CA基因突变检测技术，主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点，是目前应用较为广泛的检测方法，但测序法的灵敏度只有20％-25％，远远不能满足临床应用的需要，尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变，低灵敏度将导致大量的漏检。同时，测序法检测操作复杂，时效性差，对于要求高时效性和高灵敏度临床检测，测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术，其检测效率高，时效性强，但其高居不下的假阳性率也为临床应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题，申请人前期成功开发的“PIK3CA基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号：200810220266.1)检测方法操作简单，通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰，结果特异性好，灵敏度高，准确度达99％以上，但该方法涉及两轮PCR操作，较易造成污染，且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同)，不便于多种基因突变位点并行检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供PIK3CA基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测PIK3CA基因外显子9的两种正常基因型(542-w、545-w)和五种突变型(E542K、E545K、E545G、E545A、E545D)，以及外显子20的正常基因型(1047-w)和两种突变型(H1047R、H1047L)。

一种PIK3CA基因突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对PIK3CA基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQID NO.1～SEQ ID NO.10中的序列；所述特异性引物是：针对Exon 9Codon542的、来源于SEQID NO.11或其反向互补序列SEQ ID NO.41中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.12或其反向互补序列SEQ ID NO.42中的碱基序列；针对于Exon 9Codon545的、来源于SEQ ID NO.13或其反向互补序列SEQ ID NO.43中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.14～SEQ ID NO.17中一种以上的碱基序列，或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.47中的一种以上的碱基序列；和/或针对Exon 20Codon1047的、来源于SEQ ID NO.18或其反向互补序列SEQ ID NO.48中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.19～SEQ ID NO.20中一种以上的碱基序列，或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.49～SEQ ID NO.50中的一种以上的碱基序列；上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52～58℃之间；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；

(C)用于扩增出具有Exon 9和/或Exon 20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。