[发明专利]一种PIK3CA基因突变检测液相芯片有效

专利信息
申请号: 201010160769.1 申请日: 2010-04-23
公开(公告)号: CN102234685A 公开(公告)日: 2011-11-09
发明(设计)人: 许嘉森;李国强;余刚;秦会娟 申请(专利权)人: 广州益善生物技术有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 代理人: 万志香;曾旻辉
地址: 510663 广东省广州市广州科*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 pik3ca 基因突变 检测 芯片
【说明书】:

技术领域

发明属于分子生物学领域,涉及医学和生物技术,具体的是涉及PIK3CA基因突变检测液相芯片。

背景技术

PI3Ks(phosphatidylinositol3-kinases)是一组蛋白的多聚体,这些多聚体分为三类(ClassI、II和III)。I类(Class I)蛋白可包括两个亚单位:IA和IB。IA是由一个p110催化亚单位和一个p85调节亚单位组成的异源二聚体。PIK3CA基因是编码IA类的p110α催化亚单位。PI3Ks可由生长因子受体酪氨酸激酶(RTK)激活。PI3K的活化可产生多种生物学效应,包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等方面。

PIK3CA点突变的位点在多个外显子中都有发现,但主要是发生在“激酶”和“螺旋”两个结构域(the kinase and helical domains)。其中最常见的突变是外显子9(Exon 9)的E542K和E545K,和外显子20(Exon 20)的H1047R,如下表:

目前,已经建立的PIK3CA基因突变检测技术,主要是PCR-测序法和实时荧光定量PCR检测技术。PCR-测序法具有能够确定突变范围和类型的优点,是目前应用较为广泛的检测方法,但测序法的灵敏度只有20%-25%,远远不能满足临床应用的需要,尤其是对于异质性的肿瘤体细胞突变,低灵敏度将导致大量的漏检。同时,测序法检测操作复杂,时效性差,对于要求高时效性和高灵敏度临床检测,测序法的局限性早已凸显。而实时荧光定量PCR检测技术,其检测效率高,时效性强,但其高居不下的假阳性率也为临床应用所诟病。基于上述检测技术存在的问题,申请人前期成功开发的“PIK3CA基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法”(申请号:200810220266.1)检测方法操作简单,通过酶切富集排除了大量野生型序列造成的干扰,结果特异性好,灵敏度高,准确度达99%以上,但该方法涉及两轮PCR操作,较易造成污染,且杂交检测步骤探针较为接近(只有突变位点不同),不便于多种基因突变位点并行检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供PIK3CA基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测PIK3CA基因外显子9的两种正常基因型(542-w、545-w)和五种突变型(E542K、E545K、E545G、E545A、E545D),以及外显子20的正常基因型(1047-w)和两种突变型(H1047R、H1047L)。

一种PIK3CA基因突变检测液相芯片,主要包括有:

(A)针对PIK3CA基因的突变位点,分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对:每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成,所述tag序列选自SEQID NO.1~SEQ ID NO.10中的序列;所述特异性引物是:针对Exon 9Codon542的、来源于SEQID NO.11或其反向互补序列SEQ ID NO.41中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.12或其反向互补序列SEQ ID NO.42中的碱基序列;针对于Exon 9Codon545的、来源于SEQ ID NO.13或其反向互补序列SEQ ID NO.43中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.14~SEQ ID NO.17中一种以上的碱基序列,或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.44~SEQ ID NO.47中的一种以上的碱基序列;和/或针对Exon 20Codon1047的、来源于SEQ ID NO.18或其反向互补序列SEQ ID NO.48中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO.19~SEQ ID NO.20中一种以上的碱基序列,或来源于其反向互补序列SEQ ID NO.49~SEQ ID NO.50中的一种以上的碱基序列;上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中的一个碱基为突变位点,所述特异性引物的Tm值在52~58℃之间;

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.71~SEQ ID NO.80中的序列,且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对;

(C)用于扩增出具有Exon 9和/或Exon 20的相应突变位点的PIK3CA基因目标序列的扩增引物。

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