[发明专利]一种人小RNA-148a表达载体及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种人小RNA-148a表达载体以及该载体转染的细胞和制备治疗结直肠癌疾病药物中的应用。

背景技术

人小RNA(MicroRNA，miRNA)是一类近年发现的长度为20个核苷酸左右的非编码小分子RNA，大量的研究证明其能识别靶基因3’非编区通过不完全互补转录后沉默靶基因表达。MiRNA不仅在哺乳动物细胞的生长、增殖、凋亡和分化具有时向和组织特异性，而且在干细胞的生成过程中同样也发挥重要作用；如果我们考虑到细胞间的信号转导及相互作用可能也需要miRNA介导的调节，那么在不同肿瘤及肿瘤的不同阶段miRNA不同的表达方式也不足为奇。2002年Carlo Croce研究小组首次在慢性B淋巴细胞白血病中确认miRNA与肿瘤有直接关系以来，有关肿瘤与miRNA的研究涉及各种肿瘤，包括肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和结直肠癌等。随着miRNA芯片技术的介入，使得miRNA组学研究越来越容易。目前在与相对应正常组织比较许多肿瘤中都发现表达上调和下调的miRNA；miRNA表达谱除了能区分肿瘤组织和正常组织外，还能根据其不同的组成表达方式判断肿瘤的分型、临床分期等；LuJ等通过几百例肿瘤组织和正常组织进行系统的miRNA组学分析，成功的将这些肿瘤分类和分期，而且使人惊奇的是他们证明了miRNA组学比mRNA表达谱能更好的预测肿瘤的分型和分期。MiRNA在肿瘤中的作用与编码基因相似。同样可以作为原癌基因起作用，也可以作为抑癌基因起作用；作为原癌基因起作用的miRNA通过转录后抑制抑癌基因，使其表达下降从而促进肿瘤生成，而作为抑癌基因起作用的miRNA通过转录后抑制原癌基因而抑制肿瘤形成。因此，进一步研究miRNA的在肿瘤的发生、作用机理和功能，将会揭示肿瘤发生发展过程乃至为肿瘤诊治奠定分子基础。

发明内容

本发明目的是提供一种人小RNA-148a表达载体，是根据人小RNA-148a的前体序列设计并合成寡核苷酸片段，装载入pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR表达载体，具有SEQ ID No：1和SEQ ID No：2的互补寡核苷酸序列，SEQ ID No：1：

5’-TGCTGAGGCAAAGTTCTGAGACACTCCGACTCTGAGTATGATA

GAAGTCAGTGCACTACAGAACTTTGTCTC-3’

SEQ ID No：2：

5’-CCTGGAGACAAAGTTCTGTAGTGCACTGACTTCTATCATACTCAGAGT

CGGAGTGTCTCAGAACTTTGCCTC-3’；

本发明中的小RNA-148a表达载体通过以下方法构建：合成两条寡核苷酸片段，正义链序列(SEQ ID No：1)和反义链序列(SEQ ID No：2)；将上述合成好的寡核苷酸用双蒸水溶解成100uM，各取5μl混匀，加入退火缓冲液2μl，用双蒸水补足20μl，95℃加热5分钟，然后放置室温自然冷却20分钟。将退火后的双链寡核苷酸稀释至10nM，取4μl与2μl pcDNA^TM6.2-GW/EmGFPmiR载体混合，加入4μl连接缓冲液，用双蒸水补足20μl后16℃过夜。将连接产物加入200μl制备好的感受态大肠杆菌中，冰浴30分钟后42℃热激90秒后冰浴3分钟；加入800μl LB液体培养基，37℃，150转/分钟摇菌1个小时后取200μl菌液均匀涂布于大观霉素阳性(50μg/ml)的LB琼脂培养板上。倒置平板，37℃培养箱内12-16h，每个转化平板分别挑取3个克隆进行测序，以验证重组克隆中插入片段序列是否与设计的寡核苷酸序列一致。

本发明发明的另一个目的是提供所述人小RNA-148a表达载体在制备促进结直肠癌细胞凋亡药物中的应用。同时也在制备以BCL2基因为靶基因的抗肿瘤药物中的应用。

为了证实本发明所提供的人小RNA-148a表达载体的有效性和实用性，本发明采用脂质体转染法结直肠癌细胞系RKO细胞，经细胞培养，提取RNA，采用茎环逆转录荧光定量PCR检测了转然后RKO细胞的人小RNA-148a，结果证明了该载体能够过表达人小RNA-148a。