[发明专利]简便易行的食用菌基因组DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种食用菌基因组DNA提取方法，属于生物技术领域。

背景技术

随着现代生物技术的快速发展，食用菌的分子生物学研究也进入了一个崭新的阶段。食用菌基因组DNA的提取与分离、纯化，对于在分子水平上研究食用菌的遗传进化、基因组成、基因的重组与表达等遗传工程是十分必要的。用简便易行的提取方法获得以食用菌菌丝体和子实体为材料的基因组DNA，将能大大提高工作效率。

食用菌的细胞壁及染色体上结合有复杂的多糖和丰富的蛋白质，且其菌丝体通常会产生色素，致使制备的基因组DNA中含有不同数量的多糖、蛋白质、色素以及成分不明的胞壁物质，这些物质的存在会影响后续实验。

目前已有多种从食用菌的菌丝体或子实体中提取DNA方法的报道，提取方法区别在采取的破壁的方法不同。常用的破壁方法主要有液氮研磨法、石英砂或玻璃珠机械破壁法、CTAB法和氯化苄法等。目前采用的最多的CTAB法，采用了液氮研磨，然后用CTAB溶液在65℃处理，经过酚仿抽提进行纯化。这种方法步骤繁琐、费时费力，不易大量处理样品。其后发展出来的氯化苄法，与CTAB法相比，具有简便易行的优点，但是也存在提取DNA质量不够稳定，对分散性不好的材料提取效果不好等不足。如何快速、高效的提取食用菌菌丝体和子实体的基因组DNA成为近年来的研究热点。孙立夫等(菌物学报，2009年28卷第2期299-302)采用带有无菌塑料钻头的小型手动电钻来研磨成功提取了蜜环菌总DNA，该方法虽然避免了使用液氮，但仍然有费时的缺点；赵春喜等(安徽农业科学，2008年36卷第28期：12122-12200)尝试采用改进的TRIS饱和酚一步法从各种食用菌子实体中提取高质量DNA的简捷方法，获得的食用菌DNA质量较好，能够满足PCR等后续分子生物学试验，但此方法中仍然采用了利用研钵研磨方法，不易大量样品的处理；杨同文等(生物技术，2009年19卷第1期：32-34)探索出一种简捷、高效CTAB结合DNA凝胶试剂盒的方法，省去了苯酚-氯仿的抽提，免去了DNA的晾干和再溶解等步骤将CTAB的裂解功能与胶回收试剂盒的纯化功能有机结合，优化组合操作步骤，成功提取了平菇、香菇、金针菇子实体DNA，但该方法成本较高。

综上所述，目前提取食用菌基因组DNA的方法普遍存在着操作繁琐、提取时间长、成本较高等不足之处。

另外，以食用菌子实体为材料的核酸提取报道很少，限制了现有栽培品种的快速鉴定及野生食用菌资源分子水平上的多样性的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便易行的食用菌基因组DNA提取方法，用该方法提取食用菌的基因组DNA时间短、操作简单、成本低、提取效率高、提取的DNA质量稳定。

本发明提供的技术方案是：一种简便易行的提取食用菌基因组DNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)取材：取菌丝体或子实体于离心管中；

(2)加入少量石英砂，用研磨杵对菌丝体或子实体进行研磨至糊状；

(3)依次加入STES缓冲液，TE缓冲液，酚-氯仿液于离心管中，涡旋振荡1-3min；

(4)离心：10,000-13,000r/min离心5-7min；

(5)取离心后的上层水相至另一离心管中，加入预冷无水乙醇或异丙醇，颠倒混匀，-20℃-4℃放置沉淀15-30min；

(6)离心：10,000-13,000r/min离心10-13min；

(7)弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，风干；

(8)加入ddH₂O和RNaseA溶液中，完全溶解沉淀，-20℃保存。

上述第(1)步取材，菌丝体取气生菌丝；子实体取菌盖部位，将取好的材料置于1.5mL离心管中。

上述第(3)步中，所述STES缓冲液为200mmol/L Tris-HCl，250mmol/LNaCl，25mmol/L EDTA和2％SDS；涡旋振荡2min。

所述Tris-HCl的pH值为8.5。

第(3)步中，依次加入200μL STES缓冲液、100μL TE缓冲液、300μL酚-氯仿液于离心管中，其中酚-氯仿液中酚与氯仿的比例为1∶1。

上述第(5)步中，加入冰预冷无水乙醇或异丙醇的体积为上层水相体积的2倍，放置沉淀的温度为-20℃。

上述第(7)步中，用70％乙醇洗涤沉淀两次。

所述食用菌为黑平王、美味牛肝菌、香菇、金针菇等各种食用菌。

本发明以食用菌子实体或菌丝体为材料快速提取基因组DNA的方法，此方法有如下优点：