[发明专利]一种纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程重组尿激酶原的纯化方法，具体地说是从CHO细胞(Chinese Hamster Ovary cells，中国仓鼠卵巢细胞)表达尿激酶原的细胞培养液中纯化尿激酶原的方法。

背景技术

血栓病是一种严重危害人类健康的常见病，我国每年死于心脑血管疾病的人数仅次于癌症，尿激酶原(prourokinase，Pro-uk)也称单链尿激酶型纤溶酶原激活剂，与t-PA(tissue plasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)一样是第二代溶栓药物，特异性强，副作用小，再栓塞率低。

Pro-uk是一种单链丝氨酸蛋白酶原，由411个氨基酸残基组成的糖蛋白，分子质量54kD，等电点在9.0左右。有12对二硫键，一个N-糖基化位点(Asn302)和一个O-糖基化位点(Thr18)，具有三个蛋白结构区：(1)类表皮生长因子区(EGF-like区，第5-49位氨基酸残基组成)，(2)kringle区(50-136aa)；(3)丝氨酸蛋白酶活性部位区，其活性中心由氨基酸His204、Asp255和ser356构成。

目前，已经能够通过基因重组技术在多种基因工程细胞如大肠杆菌、哺乳动物、酵母、昆虫等细胞生产尿激酶原。已经有不同的方法纯化尿激酶原，这些方法用到了：离子交换、凝胶过滤、亲和层析等方法的组合，在中试生产过程中我们发现，当细胞培养上清中表达的尿激酶原活性较低时这些纯化方法很难除去分子量接近尿激酶的细胞杂蛋白，为了提高产品质量和生产效率我们发展了用疏水层析的纯化方法与离子交换、凝胶过滤的组合，这种方法能够有效地除去CHO细胞分泌到细胞培养上清的细胞蛋白，获得符合纯度超过95％以上的合格产品。

发明内容

本发明的目的是改进现有技术的缺陷而提供一种可以有效纯化CHO细胞表达尿激酶原的方法，该方法简单实用，能够有效地除去CHO细胞分泌到细胞培养上清的细胞蛋白，获得符合纯度超过95％以上的合格产品。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

具体纯化步骤为：

1、阳离子交换层析：用阳离子交换介质Streamline-SP扩张床，从CHO工程细胞培养上清中回收尿激酶原；

2、疏水层析：用丁基高流速琼脂糖凝胶介质(Butyl-Sepharose 4 fast flow)除去1纯化的产品中的部分杂蛋白；

3、凝胶过滤：用S-200型葡聚糖聚丙烯酰胺高效凝胶(Sephacryl S-200)凝胶色谱进一步纯化上述2收集的尿激酶原，同时去除硫酸铵。

本发明的优点与效益：

经过这三步纯化步骤尿激酶原的纯度用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其纯度能够达到95％以上，产品的回收效率在60-70％，在产品回收效率不降低的情况下，能够将细胞培养上清活性较低时的尿激酶原纯化得到合格产品，减小了细胞培养的压力，也减少了产品的损失，产品的质量和产品的产量得到了提高，该纯化方法较以前的方法更具优势。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1阳离子交换层析洗脱蛋白峰型；

图2阳离子交换层析获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱；

图3疏水层析获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱；

图4Sehacryl S-200凝胶过滤蛋白峰和硫酸铵盐峰；

图5凝胶过滤后获得的尿激酶原SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1

产尿激酶原CHO工程细胞的培养

从液氮中取出人尿激酶原工程细胞株CL-11G工程细胞复苏，在小方瓶中培养，至细胞贴壁长满后，转入转瓶中培养，细胞贴壁长满后，转入搅拌瓶中培养至Pro-uk活性达2000IU/ml细胞上清时，转入5L生物反应器中加入多孔微载体；当反应器中细胞培养上清至3000-6000IU/ml细胞培养上清时，每天能更换培养基1-1.5个工作体积时，转入30L的生物反应器中。同样加入多孔微载体并定期部分更换，使细胞不断繁殖生长，采用无血清培养基，当细胞培养上清活性达到3000IU/ml以上时收集细胞上清，每天更换上清一个工作体积以上，连续培养收获超过50d。

实施例2

阳离子交换层析从细胞培养上清中获得尿激酶原粗产品