[发明专利]一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗鸡球虫病的融合蛋白及其制备和应用。

背景技术

球虫是严重危害家禽生长发育的一类重要寄生性原虫，隶属于艾美耳科(Eimeriidae)的4个属，即艾美耳属(Eimeria)、等孢属(Isospora)、泰泽属(Tyzzeria)和温扬属(Wenyonella)。鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于鸡肠道上皮细胞引起以下痢，血便为主要特征的肠道寄生虫病，其中以柔嫩艾美耳球虫毒力较强。其发病率为50％～70％，死亡率为20％～30％，严重时可达80％。除发病死亡外，还可导致饲料报酬降低和胴体质量下降等其他损失。它是集约化养鸡业最为多发，危害严重且防治困难得疾病之一，也是所有动物疾病中经济损失最为严重的疾病之一。该病分布广泛，世界各地普遍发生，全球每年因球虫病引起的经济损失高达20亿美元；我国虽没有具体的统计数字，但随着集约化养鸡业的迅速发展，因球虫病造成的直接经济损失和防治球虫病所造成的间接损失是可想而知的。估计我国仅抗球虫药的年消费就高达2.4亿～4.8亿元人民币。

虽然人们采取了穿梭用药、轮换用药、联合用药等各种措施，但耐药虫株的出现仍是防不胜防。而新药研制费用增加(约为5亿美元)、审批周期长(可能达10年)、严格的药物检测残留标准等原因，使抗球虫药的研制和使用受到了极大限制。因此，从20世纪80年代开始，对球虫病的控制研究逐渐转向了疫苗的研制。由于不可能直接从球虫纯化出大量的可作为疫苗的抗原蛋白质，而应用DNA重组技术则有可能达到这一目的。因此大大推动了球虫分子生物学的迅猛发展。但由于球虫基因组庞大，生活史复杂，同一球虫不同的发育阶段存在各自特异性抗原和共同的特异性抗原。目前为止，只有部分基因和基因片段被克隆出来，并证实克隆出的单一重组抗原只具有部分保护性，球虫的保护性抗原可能是由各阶段虫体所具有的保护性抗原共同组成，并且有些抗原对某一种球虫有保护性，而球虫感染往往是两种或以上球虫混合感染。因此，急需研究寻找一些具有交叉免疫保护的抗原。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种融合基因、其表达的蛋白及其制备和应用。将鸡E.tenellaYL株相关抗原基因3-1E基因和TA4基因构建融合基因，后进行原核表达，可得到多抗原共表达重组疫苗，更好地防治鸡球虫病。

本发明提供的融合基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

上述融合基因的合成方法，包括如下步骤：

1)采用RT-PCR方法扩增3-1E基因和TA4基因；

2)分别将3-1E基因和TA4基因连接到载体pMD18-T上，构建克隆载体pMD18-T-3-1E和pMD18-T-TA4；

3)以步骤2)所得载体pMD18-T-3-1E为模板，进行PCR扩增，上游引物为P5：5′-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3′，下游引物P6：5′-ACCGCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGAAGCCGCCCTGGTACAG-3′；

4)以步骤2)所得载体pMD18-T-TA4为模板，进行PCR扩增，上游引物P7：5′-GGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGATGAACAAGCTGAGAAAAGCAGCAG-3′；下游引物为P8：5′-CATGTCGACCGCCGCCATATCTGTCCAAT-3′；

5)以步骤3)和步骤4)的PCR产物为模板，进行PCR扩增，上游引物为P5：5′-GCCGGATCCTTTCCTTACTCAGTTAAAATG-3′，下游引物为P8：5′-CATGTCGACCGCCG CCATATCTGTCCAAT-3′，得到3-1E-TA4融合基因。

本发明提供一种重组质粒，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，上述重组质粒是指pET-32a-3-1E-TA4。

本发明提供一种抗鸡球虫病的融合蛋白，由上述3-1E-TA4融合基因表达而得。

上述的融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

1)将所述3-1E-TA4的融合基因连接到载体pMD18-T上，构建载体pMD18-T-3-1E-TA4；

2)对分别对所述载体pMD18-T-3-1E-TA4和表达载体pET-32a(+)进行双酶切，将回收的3-1E-TA4融合基因，与表达载体pET-32a(+)连接，得到重组质粒pET-32a-3-1E-TA4；

3)步骤2)所述的重组质粒pET-32a-3-1E-TA4转化大肠杆菌；