[发明专利]一种龙脑的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种龙脑的生物合成方法。

背景技术

龙脑(Borneol)又名冰片，化学名1，7，7-三甲基双环[2，2，1]庚-2-醇。羟基处于不同的空间位置会形成相应的立体异构体，内向构型(Endo-configuration)为正龙脑，外向构型(Exo-configuration)为异龙脑。在香料和化妆品工业上，正龙脑的香味优于异龙脑；在医药方面，二者均具有抗菌、止痛、抗生育等功能，但是异龙脑副作用大。

根据制备方法的不同，龙脑可分为天然龙脑和合成龙脑，两种产品均为正龙脑和异龙脑的混合物。天然龙脑是龙脑香科植物龙脑香树脂的加工品或树干及树枝经水蒸馏升华、冷却后所得的结晶，正龙脑含量可达到75％以上。由于天然植物资源稀缺，且龙脑含量偏低(百分之几左右)，因此天然龙脑生产成本高，不能满足市场需求。目前市售龙脑多为化学法合成而得。与天然龙脑相比，合成龙脑中异龙脑含量高出10％，即正龙脑含量仅为65％。这造成两种龙脑商品价格相差较大，高纯度的天然龙脑售价每吨近80万元，医药级合成龙脑仅6万元；Sigma商品目录中显示当龙脑中正龙脑含量增加至85％，100g售价为39美元。

文献报道的化学合成龙脑有无水草酸酯化-皂化二步法、氯乙酸法合成龙脑、苯氧乙酸酯化-水解法、α-蒎烯直接水合法等。以松节油为原料的无水草酸酯化-皂化二步法是目前国内外沿用的合成龙脑的主要方法。α-蒎烯与无水草酸在硼酐及醋酐的催化下进行酯化反应生成草酸龙脑酯，加苛性钠液皂化合成游离龙脑。此法反应剧烈放热，操作极为不便，生产安全性差，产品质量差，龙脑产品中异龙脑含量常高达30-40％。氯乙酸法是将传统的酯化剂更换为氯乙酸，但反应时间长，原料循环周期过长。苯氧乙酸酯化-水解法利用α-蒎烯与苯氧乙酸反应生成苯氧乙酸龙脑酯，然后水解生成龙脑。此法转化率低，工业应用难度大。α-蒎烯直接水合法是将酯化和皂化两步反应合二为一，即利用蒎烯在催化剂的作用下直接进行水合反应，可大大简化生产工艺，但是催化剂制备技术还需完善，工业应用有待继续研究。

近年来人们开始利用微生物或酶进行天然产物的生物催化合成或修饰。由于生物催化反应过程简单、条件温和、操作方便，副反应和副产物少、能得到单一立体构型的化合物而成为关注。通过生物法制备龙脑的报道不多：一些科技人员在研究生物转化蒎烯时，发现有龙脑生成；印度学者报道了一株能转化蒎烯生成龙脑和羧酸的绿脓杆菌；日本学者也发现某种绿脓杆菌能够利用α-松油醇转化为龙脑。但这些研究中所得到的转化液龙脑浓度很低，没有什么实际应用价值，因此这些年来进行工业化研究一直是个空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够克服现有技术缺陷的龙脑的生物合成方法，其产物的性状达到甚至优于天然龙脑。

本发明是这样实现的：

本发明所述的龙脑的生物合成方法，包括生物催化剂制备、酶促水解反应、生物催化剂分离、龙脑产品分离，其工艺过程如下：将菌株在发酵培养基中进行发酵，然后离心发酵液收集细胞作为生物催化剂；将制备好的生物催化剂加入到含乙酸龙脑酯的有机溶剂-缓冲盐混合液或缓冲盐溶液中，进行酶促水解反应；酶促水解反应结束后，用过滤的方法将生物催化剂分离出来重复使用；分离生物催化剂后，采用常规的分离方法将龙脑产品从反应液中与未反应的乙酸龙脑酯分离，得到龙脑产品。

以上所述的龙脑的生物合成方法，其生物催化剂制备所用的菌种为特氏克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。该菌种可以从微生物中心购买，或者自己分离培养得到。

以上所述的龙脑的生物合成方法，其生物催化剂制备所用的发酵培养基主要成分包括玉米粉、蛋白胨、淀粉、蔗糖、葡萄糖、废糖蜜、马铃薯汁、牛肉膏、KH₂PO₄、MgSO₄、NaCl、(NH₄)₂SO₄中的一种或者多种的混合物，用量分别为：淀粉、玉米粉或蛋白胨5～20g/L，蔗糖、葡萄糖、废糖蜜或马铃薯汁5～20g/L，牛肉膏1.0～5.0g/L，KH₂PO₄ 0.5～1.5g/L，MgSO₄0.05～0.5g/L，NaCl 0.2～2.0g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.5～5.0g/L；生物催化剂制备的发酵条件为：25～50℃，pH5.5～9.0，转速100～400rpm，培养时间1～3天。