[发明专利]一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育

权利要求书

1.一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，其特征是以从自然界土壤中筛选的菌株作为供试株，以葡萄糖为底物微生物法生产2，3-丁二醇，筛选得到的1株枯草芽孢杆菌菌株Bacllius subtilis 6-7，该菌能以葡萄糖为底物进行发酵，在发酵液中测得2，3-丁二醇；

(1)菌株的筛选：

菌种筛选：将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37℃，150r/min摇床10h，取不同稀释度稀释涂布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉18g/L pH7.0)上进行划线分离，37℃培养1d-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基，作初筛备用；从斜面上挑取菌株到种子培养基中培养，将用种子培养基培养到对数期的种子，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测；

(2)2，3-BDO定性检测：

取2ml上清液，用2ml乙酸乙酯进行萃取，然后采用气质联用(GC-MS)鉴定萃取液中是否含有2，3-BDO。气质联用检测条件：采用的色谱柱温控程序为：首先在60℃下保温1min，然后以6℃/min的升温速率升至90℃并保持2min，最后以30℃/min的升温速率升至180℃，恒温2min。进样口温度为250℃，进样量为1μL，载气为高纯氦气，载气流量1.2mL/min，检测器温度为240℃；

TraceMS质谱条件：EI+轰击源，全扫描方式，扫描质量范围为30～500amu，发射电流为200μA，电子能量为70eV，质谱检测谱库为NIRT98谱库；

(3)菌株鉴定

提取出发菌株的基因组DNA

以出发菌株的基因组DNA为模板，使用酵母菌16S rDNA的通用引物进行扩增

正向引物为f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

反向引物为r：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’

PCR方法如下：50μL反应体系中加入：10mol/L的引物f和r各0.5μL，2mmol/L的dNTP 5μL，10×ExTaq Buffer 5μL，5U/μL的ExTaq DNA聚合酶0.5μL，模板1μg，加双蒸水补齐50μL；PCR条件为：95℃变性5min，56℃退火90S，72℃延伸2min，94℃变性1min，循环30次；

用胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，电泳验证；连接到pMD18-T载体，转化E.coli JM109。经氨苄青霉素抗性筛选，获得阳性克隆。16S rDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在NCBI中与数据库已有序列进行比较分析。

2.根据权利要求1所述的酵母菌株的16S rDNA分析，该酵母菌株分类名称为：Baclliussubtilis，将其命名为Bacllius subtilis 6-7。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌菌株，其特征是将枯草芽孢杆菌接种于50mL种子培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖20g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)的250mL的三角瓶中，37℃，150r/min，培养7h后，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测，测得2，3-丁二醇的含量为49.6g/L。