[发明专利]一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育

说明书

技术领域

一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，属于生物工程中发酵技术领域。

背景技术

2，3-丁二醇，英文名为2，3-butanediol，简写为2，3-BDO，是无色结晶或液体，熔点23-27℃，沸点170-182℃，具有吸水性，能与水和醇相互混溶，能溶于醇和醚。

2，3-BDO是一种重要的化工原料和医药前体，例如它可以脱水形成1，3-丁二烯，可用于合成橡胶、聚酯和聚亚胺酯；酯化形式的2，3-BDO是合成聚亚胺的前体，可应用于药物、化妆品、洗液等。此外2，3-BDO还可作为风味物质添加到白酒和奶油中。2，3-BDO可以通过化学合成法和微生物生产法两种，由于2，3-丁二醇结构特殊，化学法生产2，3-丁二醇主要是以石油裂解时产生的四碳类碳氢化合物在高温高压下水解得到，成本高、过程繁琐、不易操作，所以一直很难实现大规模的工业化生产。随着石油价格的日益攀升，用微生物发酵法生产2，3-丁二醇并对其衍生物进行开发研究逐渐引起了人们的关注。发酵法生产2，3-丁二醇有许多优点：首先在成本上具有优势，化学法生产成本比较高；其次，发酵法具有对环境友好的特征，2，3-丁二醇作为有机合成中间体取代了许多的化合物和其它石化产品的市场，前景广阔，社会、环境效益显著，非常有利于该产品的广泛应用；第三由于发酵法生产2，3-丁二醇是以可再生资源为原料的，因此本身摆脱了对石化原料的依赖，具有很好的应用前景。目前，2，3-丁二醇的工业化主要是发酵法，有关研究国外进行的较早，取得的成绩比较显著，国内研究还处于初级阶段，国内外发酵法产2，3-丁二醇的研究常用的菌种大都是克雷伯氏菌，而克雷伯氏菌具有潜在的致病性，限制了其工业化的应用。

本发明筛选到以葡萄糖为底物高产2，3-丁二醇的微生物菌株，对该菌进行了鉴定，确定其为枯草芽孢杆菌，是环境安全菌株具有较大的工业应用前景，对其发酵条件进行了初步研究，在5L发酵罐上的产量可以达到61.7g/L，为微生物发酵法产2，3-丁二醇的工业化提供了基础。

发明内容

本发明的目的在于提供：从自然界的土壤中筛选到能够以葡萄糖为底物发酵产2，3-丁二醇的菌株，并对其进行了形态学与遗传学方面的鉴定，将该菌命名为6-7。对发酵产物进行了定性定量鉴定，为微生物发酵法生产2，3-丁二醇的工业化提供了有益的指导。

本发明的技术方案：一种通过微生物发酵产2，3-BDO的方法，是在初始发酵培养基中，以从自然界土壤中筛选的菌株为生产菌株，控制温度37℃，摇床发酵72h，通过气质联用定性检测发酵液中物质成分然后再通过液相色谱定量检测发酵液中物质的含量，筛选出能以葡萄糖为底物发酵产2，3-BDO的菌株。本发明成功筛选到一株能以葡萄糖为底物发酵产2，3-BDO的菌株，通过16S rDNA鉴定，将其命名为Bacllius subtilis 6-7，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CTCC M 2009200。

主要试剂：

2，3-BDO  购自美国Sigma-Aldrich公司

2，3-BDO    分析方法的确定：

2，3-BDO标样在Sugarpakl糖柱上通过液相色谱进行分析，不同构型的2，3-BDO保留时间分别为19.3min和22.5min。所用液相色谱仪为Waters，糖柱Sugarpakl(6.5mmid×300mm)。

确定具体色谱条件为：糖柱Sugarpakl(6.5mmid×300mm))；柱温：85℃；流动相：纯水；流速0.4ml/min；进样量为10μL；检测器：示差折光检测器。

目的菌株的筛选：将采集到的样品在种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L pH 7.0)中富集，37℃150r/min摇床l0h，取不同稀释度稀释涂布培养。挑单菌落在平板分离培养基(酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉18g/LpH 7.0)上进行划线分离，37℃培养1d-2d，镜检，待试菌株保藏于斜面保藏培养基，作初筛备用；将用种子培养基培养到对数期的种子，按5％接种量加入到含有15％葡萄糖的发酵培养基中，然后置于37℃、150r/min条件下振荡培养72h。收集发酵液，离心，取上清液以备检测。