[发明专利]葡萄离体茎段的脱毒方法

说明书

技术领域

本发明涉及果树生物技术领域，具体的说，涉及一种葡萄离体茎段的脱毒技术。

背景技术

目前国内已报道葡萄病毒病主要有9种：扇叶病、卷叶病、茎痘病、栓皮病、斑点病、脉坏死病、耳突病、星状花叶病和缩叶病。其中，扇叶病与卷叶病是我国葡萄生产中分布最广、危害最严重的病毒病种类。据调查，目前我国葡萄栽培区域内，85％以上的葡萄园普遍发病，给葡萄生产带来了极大的损失。郭德银等采用间接ELISA法，随机检测了35个葡萄品种，带扇叶病毒率高达74.3％。何水涛等对国家葡萄种质资源圃(郑州)内39个品种共78株葡萄进行了PAS-ELISA检测，带毒率为76.9％。

鉴于繁殖材料带病毒是葡萄病毒病的主要传播途径，因此，对葡萄繁殖材料进行病毒脱除，建立无病毒的葡萄原原种圃、母本园和苗圃等无病毒苗木的生产体系，以保证栽植材料健康无毒，是防治葡萄病毒病的关键。

据报道，目前用于脱毒最有效的方法是“热处理并结合茎尖培养”。尚志华将转接后20天的组培苗置于光照1000-2500Lx的培养箱内，起始温度设为34℃，以后每天升高1℃，直到37℃(白天37℃，夜间25℃)，热处理40-60d后，剥取0.5mm的茎尖，经检测的脱除率可达62.5％；张金文等用此方法对7个葡萄品种进行病毒脱除，将试管苗置于35-37℃温度下热处理45-60d，结果发现葡萄扇叶病毒和卷叶病毒脱毒率高达92％。

根据目前的报道，对葡萄栽植材料的脱毒虽然取得了很好的进展，但仍存在许多问题，主要为：(1)用于脱毒的试管苗材料不耐热，脱毒过程中植株死亡，获得的微茎尖数量少；(2)需要将温度逐渐升高或昼夜变化，并同时控制湿度和光照，对研究环境及条件设施要求严格，通用性差；(3)程序繁杂，脱毒需要的时间长，因此培育葡萄无病毒苗木的周期也相对较长；(4)从试管材料的准备、生根到茎尖培养需要不同的培养基；(4)前人发表的一些文章虽然获得了较高的脱毒率，但并未与脱毒前材料的带毒情况作比较，因此其较高的脱毒率也有待进一步实验。

针对这些问题，我们借助前人的经验开展了进一步的研究，旨在创建一种脱毒率高、操作方便简单、通用性强的高效脱毒技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种葡萄离体茎段的脱毒方法。此方法既不要求光照，也不要求频繁变温处理，操作简单、省时、省电、省工，效率高、成本低，对研究环境及条件设施要求不十分严格，只要具备组培条件的研究及教学单位均可应用。

本发明所述的葡萄离体茎段的脱毒方法，包括如下步骤：

1)选择继代培养至茎半木质化的葡萄品种或相关砧木的试管苗，无菌条件下剪取单芽茎段接种在培养基中，置于22-28℃、2000-3000lx培养室培养至刚露出小白根，得到葡萄离体茎段；

2)将葡萄离体茎段置于35-40℃的培养箱中，暗处理并同时进行热处理；

3)热处理10d后开始观察侧芽生长情况，当黄化嫩梢长至6-10cm，在无菌条件下剥取0.2-0.8mm左右的微茎尖，置于培养基中培养，直至得到繁殖材料。

其中，本发明的方法中，步骤1)和3)都采用同一种培养基，所述培养基是添加了0.1-0.5mg/L IAA，15-30mg/L蔗糖，以及4.5-7.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基。

优选的，所述培养基是添加了0.2mg/L IAA，20mg/L蔗糖，5.0mg/L琼脂或明胶，pH为5.8的改良B5培养基。其中，IAA是吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid)的简称，生物学名称为生长素，是一种植物激素。

其中，所述蔗糖可选用白砂糖、绵白糖等本领域常用蔗糖中的一种或多种。

改良B5培养基的配方包括下表的各组分：