[发明专利]一种获得转基因棉花的方法

权利要求书

1.一种获得转基因棉花的方法，包括如下步骤：

(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度，得到待侵染组织；然后25-30℃、相对湿度40％-60％、暗培养2-3天；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm的无菌苗；

(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤口深0.8-1.2mm；

(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；

(4)侵染完成后共培养2-4天，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；

(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5.8，由溶质和水组成；所述溶液A的溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮40-120μl·L^-1，2-N-吗啉乙烷磺酸65-85mM、葡萄糖2-3％(质量百分含量)、激动素0.08-0.12mg·L^-1、含有外源基因的重组农杆菌OD₆₀₀＝0.6-0.8。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述抗性筛选在筛选培养基上进行；所述筛选培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素、卡那霉素和头孢霉素组成；筛选培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L^-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L^-1，激动素的终浓度为0.1mg·L^-1，卡那霉素的终浓度为50-100mg·L^-1，头孢霉素的终浓度为250-500mg·L^-1。

4.如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述共培养在共培养基上进行；所述共培养基由MS基本培养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；共培养基中，琼脂的终浓度为7.5g·L^-1，甘氨酸的终浓度为2mg·L^-1，激动素的终浓度为0.1mg·L^-1。

5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述MS基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述外源基因为抗虫基因Cry2A^*、AGP启动子或GFP基因；所述抗虫基因Cry2A^*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP启动子的核苷酸序列如序列表的序列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述重组农杆菌为用携带所述外源基因的重组质粒转化农杆菌得到的重组农杆菌。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述重组农杆菌为如下(a)或(b)或(c)：

(a)用重组质粒pTiBO542转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；

(b)用重组质粒pBIαGUS转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIαGUS是将pBI121的HindIII和Xba I酶切识别位点之间的小片段取代为序列2所示的DNA得到的重组质粒；

(c)用重组质粒pBIαGFP转化农杆菌LBA4404得到重组农杆菌；所述重组质粒pBIαGFP是将pBIαGUS的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为序列3所示的DNA得到的重组质粒。

9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述棉花为棉花品种冀丰197或棉花品种鄂抗棉12。

10.权利要求1至9中任一所述方法在棉花育种中的应用。