[发明专利]一种获得转基因棉花的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，涉及一种获得转基因棉花的方法，具体涉及一种以棉花茎尖为受体、通过农杆菌介导获得转基因棉花植株的新方法。

背景技术

棉花是一种重要的经济作物，在国民经济中占有重要地位。棉花转基因技术在遗传改良方面已取得重大进展，成为生物技术在作物遗传改良中成功应用的范例。目前，转基因植物的遗传转化方法以农杆菌介导转化法应用最为广泛。由农杆菌介导基因转化技术具有不受季节限制、目的基因多为单拷贝或低拷贝、插入边界多为T-DNA左右边界，重排率低、容易排除冗余的质粒DNA序列、容易获得无选择标记的转基因植株等优点而倍受青睐。自从1987年Umbeck等首次报道了通过农杆菌介导法将NPT II基因导入棉花，1994年陈志贤等也利用此法获得导入2，4-D抗性基因的陆地棉植株，随之Bt基因、CPTI基因也相继导入棉花，这种由农杆菌介导基因转化技术迅速发展起来。

根据棉花遗传转化受体的类型，棉花以农杆菌介导的细胞核遗传转化主要技术体系有：以胚性愈伤组织为受体的转化体系、以下胚轴为受体的转化体系、以茎尖分生组织为受体的转化体系。以胚性愈伤组织和下胚轴为受体的两种转化体系都必须要经过体细胞胚胎发生和植株再生，由于在诱导愈伤组织过程中要经过分化、再分化过程，能产生很多遗传变异和体细胞变异，植株再生困难，转化周期长，目前报道最短的植株再生所用的时间在五个月以上；基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定性作用，同一棉属不同棉种之间、同一棉种不同品种之间体细胞胚胎发生和植株再生的能力不同，只有少数品种离体培养的材料可以诱导出胚性愈伤组织，限制了遗传转化的品种范围。

以茎尖分生组织为受体的农杆菌转化法不经过脱分化、再分化过程，遗传变异和体细胞变异程度低；受棉花基因型限制的影响较小，许多未能实现体细胞胚胎发生和植株再生的棉花品种也可以成功进行遗传转化。自从Renfroe等报道利用棉花茎尖分生组织获得再生植株以来，国内外很多学者都利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因再生植株。但通常转化率低，且由于不定芽起源于多细胞，嵌合体比较多等因素的限制影响再生苗的获得。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得转基因棉花的方法。

本发明提供的获得转基因棉花的方法，包括如下步骤：

(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度(可为0.8-2cm，如0.8-1.5cm，1.5-2cm)，得到待侵染组织；然后25-30℃(如25-28℃，28-30℃)、相对湿度40％-60％(如40％-50％，50％-60％)、暗培养2-3天(如2-2.5天，2.5-3天)；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm(如4-5cm，5-6cm)的无菌苗；

(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤口深0.8-1.2mm(如0.8-1mm，1-1.2mm)；

(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟(如15-30分钟，30-35分钟)；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；

(4)侵染完成后共培养2-4天(如2-3天，3-4天)，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；

(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。

相对湿度，表示空气中的绝对湿度与同温度下的饱和绝对湿度的比值，得数是一个百分比(也就是指在一定时间内，某处空气中所含水汽量与该气温下饱和水汽量的百分比)。

步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5.8(如5.3-5.6，5.6-5.8)，由溶质和水组成；所述溶液A的溶质及其浓度如下：乙酰丁香酮40-120μl·L^-1(如40-80μl·L^-1，80-120μl·L^-1)，2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)65-85mM(如65-75mM，75-85mM)、葡萄糖2-3％(w/w，质量百分含量)(如2-2.5％，2.5-3％)、激动素(KT)0.08-0.12mg·L^-1(如0.08-0.1mg·L^-1，0.1-0.12mg·L^-1)、含有外源基因的重组农杆菌OD₆₀₀＝0.6-0.8。