[发明专利]用于检测Hg2+的核酸纳米金生物传感器

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，涉及一种快速检测Hg²⁺的生物传感器。

背景技术

目前汞检测的主要方法是光谱法，包括原子(吸收、发射、荧光等)光谱方法以及分光光度法等。近年来，原子光谱与电感耦合发射光谱的联用，提高了检测的灵敏度，拓宽了检测的线性范围，而电感耦合等离子体质谱使检测更加灵敏，数据分析更加方便。但是，此类仪器较为昂贵，在大多数实验室中的推广应用因此受到限制。除光谱法外，以冠醚类小分子为代表的化学传感方法也有一定的发展，但尚有灵敏度低、可重复性差等不足之处，检测的可靠性和准确性也不足。

近年来，纳米材料的发展为解决这一问题提供了新的思路。纳米金颗粒具有优异的光学性质、电学性质、化学活性和生物兼容性，在生物领域得到广泛应用。研究表明，纳米金溶液的颜色与纳米金颗粒的间距以及纳米金聚集体的大小有关。纳米金颗粒的间距若明显超过其平均直径，纳米金呈分散状态，宏观上表现为红色；该间距若小于平均直径，则纳米金易团聚，呈聚集态，宏观上表现为紫色到蓝色。利用纳米金的这种性质，可设计一系列生化反应以改变纳米金颗粒间的距离，从而实现对靶物质的检测。最近，Ono等(Ono A，TogashIH.Angew Chem Int Ed，2004，43(33)：4300-4302)利用Hg²⁺与DNA的特异性作用，设计了一种新型生物传感方法，通过检测两端标记的DNA探针结合Hg²⁺后产生的荧光变化实现对Hg²⁺的特异性检测。该方法具有较高的特异性，可排除实际样品体系中大多数离子的干扰，但是检测灵敏度不高，而且需要进行DNA双标记，还依赖于荧光仪器，检测成本仍然较高。

发明内容

本发明的目的是克服现有Hg²⁺检测技术存在的问题和不足，提供了一种用于Hg²⁺快速检测的新工具，即核酸纳米金生物传感器，利用Hg²⁺存在时，T-T碱基能够互补配对的原理，配合胶体金放大系统，用来检测Hg²⁺，因而能快速检测Hg²⁺、不需要仪器，使用方便，且灵敏度高。

本发明所述的一种用于检测Hg²⁺的核酸纳米金生物传感器，包括检测试纸条、检测核酸试剂和上样缓冲液；

所述检测试纸条从左到右依次由固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；

所述玻璃纤维上涂有纳米金标记的第一核酸，其序列如SEQ ID NO.1所示，该核酸序列的5’端标记巯基并与胶体金颗粒偶联，3’端标记生物素；

所述硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；质控线上固定有第三核酸，其序列如SEQ ID NO.3所示，该核酸序列的5’端标记生物素，与链霉亲和素反应后，固定在硝酸纤维素膜的质控线上；检测线上固定有链霉亲和素；

其中，第三核酸序列与第一核酸序列特异性互补；

所述检测核酸试剂含有第二核酸，其序列如SEQ ID NO.2所示，从5’端开始第6个碱基处与第一核酸序列有T-T碱基的错配；所述检测核酸试剂与待检测溶液及上样缓冲液一起滴在所述样品垫上；

所述上样缓冲液为4X核酸杂交液，含：0.6M氯化钠，0.06M柠檬酸钠。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述质控线与检测线相距3-10mm。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述固定于胶板上的样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜和吸水纸的相邻部分彼此重叠1-5mm。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述胶体金的粒径为8-100nm。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金的制备方法包括：选用粒径为8-100nm的胶体金颗粒，胶体金采用常规的氯金酸煮沸还原法制备，通过控制还原剂的量在0.01％-0.05％以及搅拌速度在1000-50000转之间来控制颗粒粒径。

根据本发明所述的核酸纳米金生物传感器的进一步特征，所述的纳米金与核酸序列的偶联与封闭老化的方法包括：将巯基修饰的第一核酸序列加入到5倍体积浓缩的纳米金溶液中，混合，在4-37℃反应10-24小时，用1％牛血清白蛋白封闭多余的活性位点，30分钟后加入NaCl和SDS使其终浓度分别至0.15M和0.01％，老化10-20小时后，10000-16000转/分钟离心20-60分钟，弃上清，即可获得所述的纳米金标记寡核苷酸探针，将此纳米金标记寡核苷酸探针沉淀用重悬液重新悬浮，4℃保存。