[发明专利]稳定的α-半乳糖苷酶水性组合物及其相关方法

说明书

技术领域

本发明涉及水性组合物，该水性组合物包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白。本发明还涉及使包含具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的水性组合物稳定的方法，以及制备包含所述的具有α-半乳糖苷酶酶活性的蛋白的纯化的水性组合物的方法。

背景技术

于1900年发现的ABO血型系统，在人类的输血中发挥重要作用，并因此在输血药物中发挥重要作用。ABO血系统是基于是否分别存在或不存在A和B血型抗原。对应的血型碳水化合物结构(被称为ABH)被发现于红细胞表面，特别是糖蛋白和糖脂的寡糖链的末端。也就是说，在A型血红细胞上发现的A抗原由末端的α-1，3连接的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)确定，而B型血上的B抗原由末端的α-1，3连接的半乳糖(Gal)单糖(作为免疫显性的单糖)确定。

对碳水化合物有活性的酶在自然界中广泛分布并在很多生物技术和制药学过程中具有应用(Davies等人，2005)。通过酶作用除去ABO血型抗原而产生通用的红血细胞是最初于超过25年之前提出的先驱性观点。因此，分别从A型血和B型血细胞上通过酶作用除去α-1，3连接的N-乙酰半乳糖胺和α-1，3连接的半乳糖单糖提供了改善输血安全性和总体血液供给的有吸引力的方式。最初预想是通过使用外切糖苷酶选择性除去免疫显性的A和B三糖抗原的α-GalNAc和α-Gal残基，从而通过酶作用分别将红血细胞上的A和B抗原转化为H抗原。特别地，α-N-乙酰-半乳糖胺酶和α-半乳糖苷酶在A、B和AB血型红血细胞的酶式转化中具有特别的意义(WO 03/027245A2)。外切葡萄糖苷酶α-N-乙酰-半乳糖胺酶(A-zyme)特异性水解A型红血细胞上的末端α-1，3-GalNAc残基，外切葡萄糖苷酶α-半乳糖苷酶(B-zyme)特异性水解B型红血细胞上的末端α-1，3-半乳糖残基。两种酶反应均引起在O型红血细胞上发现的普遍的H结构的形成。

为了转化B型红血细胞，首先使用了源自绿咖啡豆的α-半乳糖苷酶。证明红血细胞的酶式转化是可行的，并且此外还证明转化的血细胞可以在输血中发挥作用，由于需要大量的酶，所以不可能用于临床应用。最近描述了使用来自海洋细菌假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas spec.)的α-半乳糖苷酶从B型血的红细胞中除去α-1，3-结合的半乳糖残基(Bakunina等人，1998)。另外，报道了两种细菌半乳糖苷酶基因家族，其提供能够在中性pH以低消耗重组酶而有效除去A和B抗原的酶(Liu等人，2007)。在这些酶之中有一种是源自细菌生物脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的α-半乳糖苷酶的重组N-末端片段。

自从在20世纪70年代出现以来，重组DNA技术已经使生物化学发生改革。在一个方面，由于最近发展的与基因克隆和聚合酶链反应(PCR)提供的扩增相结合的微化学技术的敏感性，来自任何种类的细胞或组织的内源性蛋白及其对应的信使RNA可以作为分离和克隆其各自基因的起点。在另一个方面，重组DNA技术为有效地大规模生产所鉴定和分离的基因铺平了道路，因为重组DNA技术能够将编码目的蛋白的DNA引入宿主生物或引入为了重组蛋白表达的目的而生长于培养物中的细胞。特别地，细菌被认为是基因扩增和基因表达的理想宿主，因为它们代表了用于生产众多的原核和真核蛋白的容易操作的工厂。但是，细菌宿主细胞中表达重组异源蛋白的表达经常会引起包涵体(其含有聚集和不可溶形式的目标蛋白)的形成，结果是所表达的蛋白不能进行进一步的生物化学纯化。在这种情况下，重组蛋白的回收需要包涵体的溶解并需要蛋白重新折叠成其活性结构。