[发明专利]利用戊二醛诱发红外荧光测定溶液蛋白质浓度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种测量方法，尤其是一种测定蛋白质浓度的方法。

背景技术

蛋白质浓度测定是在生命科学研究中经常使用的技术。目前有许多方法用于蛋白质浓度测定，但是又各有局限：经典的紫外分光光度法灵敏度有限；常规的BCA、Lowry法等又涉及相对复杂的试剂配制；有的方法，如公开号为CN168774的中国专利操作步骤复杂，容易引入人为误差，导致测量结果的准确性下降；有的方法，如如欧洲专利G01N33/68A12，美国专利US2010047913等，将液相层析和质谱联用，虽然提高了检测的灵敏度及准确性，但是由于层析和质谱设备的昂贵限制了其使用，而且该类方法耗时较长，不易于实现快速的批处理操作。

发明内容

为了克服现有技术计数成本高昂、操作耗时长等不足，本发明提供了一种测定蛋白质浓度的方法，成本低廉，操作简便快捷。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案包括以下步骤：

1.将待测的未知浓度的实验组蛋白质溶液和1组至少4个已知浓度且浓度不同的标准组蛋白质溶液各0.5-2μL滴加在硝酸纤维素膜上；

2.将硝酸纤维素膜自然晾干；

3.将硝酸纤维素膜整个放入质量百分比浓度为0.1％～10％的戊二醛溶液，将溶液和硝酸纤维素膜加热至40℃～80℃，并保温5～60分钟；

4.用磷酸盐缓冲液(PBS)或水或生理盐水清洗硝酸纤维素膜两次以上；

5.使用红外激光扫描成像系统，选择660nm-710nm之间任一波长激光激发，在大于激发激光波长至少40nm处检测硝酸纤维素膜上各蛋白质溶液斑点的荧光强度；

6.结合标准组蛋白质溶液的已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I_标准与蛋白质溶液浓度N_标准的关系公式：I_标准＝a×N_标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；

7.根据标准曲线和实验组蛋白质溶液斑点的荧光强度I_实验计算实验组蛋白质溶液浓度N_实验，即N_实验＝(I_实验-b)/a。

由于通常情况下待测的实验组蛋白质溶液虽然未知浓度，但是其浓度的数量级基本是可以确定的，因此，所述标准组蛋白质溶液中应至少有一个的蛋白质浓度大于实验组蛋白溶液浓度，并且至少有一个的蛋白质浓度小于实验组蛋白溶液浓度。否则将导致无法获得所述的标准曲线，就需要重新调整标准组蛋白质溶液浓度。

所述硝酸纤维素膜应当足够大，至少使各蛋白质溶液滴加在其上后形成的斑点之间不相互重叠干扰。

所述的戊二醛溶液采用水或生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)作为溶剂配制。

本发明的有益效果是：由于采用戊二醛溶液对点有蛋白质样品的硝酸纤维素膜进行浸泡处理，在起到固定蛋白质作用的同时，利用戊二醛与蛋白质相互作用产生红外荧光这一现象，结合红外荧光检测设备对蛋白质进行定量，与现有技术相比，本发明体现了降低成本，提高速度，减少操作时间，利于批量操作。

下面结合实施例对本发明进一步说明。

具体实施方式

实施例1：使用本发明所述方法进行蛋白质定量

1.牛血清白蛋白(BSA)以未知浓度(实验组)及已知浓度(标准组)1250ng/μL、625ng/μL、312.5ng/μL、156.25ng/μL、78.125ng/μL、39.06ng/μL、19.5ng/μL、9.75ng/μL、4.88ng/μL溶液，每个样品2μL滴加在硝酸纤维素膜上；

2.将硝酸纤维素膜自然晾干；

3.将硝酸纤维素膜整个放入戊二醛浓度为0.1％的生理盐水溶液中，将溶液加热到80℃，保温30分钟；

4.用水清洗硝酸纤维素膜两次以上；

5.使用红外激光扫描成像系统，选择680nm波长激光激发，在大于激发激光波长720nm处检测样品的荧光强度；

6.结合标准组已知蛋白质浓度与荧光强度绘制标准曲线，得到荧光强度I_标准与蛋白质浓度N_标准的关系公式：I_标准＝a×N_标准+b，其中a为一元线性相关系数，b为截距，皆通过标准曲线计算得知；

7.根据标准曲线和实验组蛋白质样品的荧光强度(I_实验)计算实验组蛋白质浓度(N_实验)，即N_实验＝(I_实验-b)/a。