[发明专利]肠道病毒71型抗体(IgM)诊断试剂盒(酶联免疫法)

权利要求书

1.一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒，其特征在于该试剂盒包括抗人-IgM(μ链)单克隆抗体预包被的微孔板、辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒71型抗原、阳性对照血清、阴性对照血清、浓缩洗涤液(20×)、底物液A、底物液B和终止液。

2.根据权利要求1所述的一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

2.1.抗人-IgM(μ链)单克隆抗体预包被微孔板的制备

2.1.1包被

0.05mol/L(0.05毫摩尔/升)，pH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲系统，加入适量抗人-IgM(μ链)单克隆抗体，混匀后按每孔100ul(微升)加入到微孔板中，37℃放置2小时，室温过夜，然后甩去孔内液体，拍干；

2.1.2洗涤

0.01mol/L PBS-T(0.01毫摩尔/升磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲系统，0.05％的Tween-20)，pH7.2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重复洗涤一次，拍干。

2.1.3封闭

0.01mol/L PBS，10％小牛血清，0.25％酪蛋白，0.1％硫柳汞钠，pH7.2，按每孔加入110ul的量加入到微孔板中，37℃放置2小时，然后甩去孔内液体，拍干；

2.1.4干燥

封闭后的微孔板，甩去孔内液体拍干后，放置于干燥室(相对湿度小于45％)过夜，然后放入有干燥剂的铝箔袋中封口，保存于2～8℃环境。

2.2.酶标抗原工作液的制备

0.01mol/L PBS，10％小牛血清，0.25％酪蛋白，1/1000 Proclin300，pH 7.2的buffer中加入适量辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒71型VP1抗原，保存于2～8℃环境。

2.3.阳性对照的制备

取A₄₅₀值≥2.0的抗EV71-IgM阳性多份人血清混匀，用56℃水浴锅加热120分钟，用0.01mol/L PBS，20％BSA，pH 7.2的buffer调整到A450值＞1.0，加入万分之五的硫柳汞钠，保存于2～8℃环境。

2.4.阴性对照的制备

取A450值＜0.1的抗EV71-IgM阴性多份人血清混匀，用56℃水浴锅加热120分钟，自然冷却后，加入万分之五的硫柳汞钠，保存于2～8℃环境。

2.5.底物液A

Na₂HPO₄.12H₂O        18g

柠檬酸.H2O           5g

乙酸钠               9.25g

乙酸                 1.2ml

Na₂O₂                5g

去离子水             1000ml，pH5.0

2.6.底物液B

先用5mlDMSO(二甲亚砜)溶解0.25g TMB(3，3，5，5-四甲基联苯胺)；取1000ml去离子水加入约1ml浓盐酸，混匀后pH2.5，将TMB溶液加入到盐酸溶液中混匀。

2.7.终止液

浓硫酸      100ml

去离子水    800ml

2.8.20X浓缩洗涤液

Na₂HPO₄.12H₂O      58g

NaH₂PO₄            8g

NaCL               160g

Tween-20           10.0ml

去离子水           1000ml，调整pH7.2

3.一种人血清中肠道病毒71型抗体(IgM)测定方法，其特征在于该方法包括下列步骤操作：

3.1.取出试剂盒置室温平衡30分钟。将20×洗涤液用蒸馏水做20倍稀释。

3.2.加样品：取出包被板，作好标记，留1孔空白对照，其余加入阴性对照3孔阳性对照2孔50ul/孔及待测标本50ul/孔于相应的反应板孔内，空白对照不加。将反应板轻轻震荡混匀后，用封板膜封板，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。

3.3.洗板：温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30秒钟。

3.4.加酶标工作液：每孔加入50ul酶标工作液，空白孔除外。

3.5.温育：用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应30分钟。

3.6.洗板：温育后，将封板膜揭掉，吸干孔内液体，用洗涤液洗板5次，每次浸泡30秒钟。

3.7.显色：每孔加入底物A、B液各50ul，震荡混匀，用封板膜封板后，置37℃温箱或水浴中反应15分钟

3.8.终止：每孔加入终止液50ul，轻轻震荡混匀。

3.9.测定：设定酶标仪波长于450nm(建议双波长450/630nm检测)，测定各孔A450值。注意：在终止反应30分钟内读数。当使用单波长时，校准空白孔，设定酶标仪波长于450nm，测定各孔A450值，当使用双波长450/630nm检测时，可以不设空白孔，直接测定各孔A值。