[发明专利]肠道病毒71型抗体(IgM)诊断试剂盒(酶联免疫法)

说明书

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种检测肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒及其制备方法和应用。

技术背景：

肠道病毒EV71型感染是由人肠道病毒71型(EV71)引起的疾病的总称，临床上主要表现为手足口病，手足口病多在婴幼儿中爆发流行，部分EV71感染患儿表现为疱疹性咽峡炎，重症患者出现病毒性脑炎、病毒性脑脊髓膜炎、肺水肿、肺出血等。引起手足口病的病原，最常见的是柯萨奇病毒A16和肠道病毒71型；由肠道病毒71型感染引起的疾病发生重症感染的比例较大，病死率也较高，重症病例病死率可达10％-25％，因此病原学诊断意义重大。

肠道病毒71型(EV71)基因组为含有大约7.5Kb的单股正链RNA，包括5’端非编码区、3’端非编码区和由P1、P2、P3所组成的多蛋白，共编码11种蛋白，其中4个结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4，7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D。其中VP1、VP2、VP3暴露于病毒外壳的表面，为EV71主要的抗原变异位置；VP4包埋在病毒外壳的内侧与内部的RNA结合，其功能类似病毒外壳的锚，用以稳定病毒蛋白的结构。非结构蛋白2A为分裂初期先驱蛋白质，也与终止宿主细胞合成其本身所需蛋白有关；3C则参与大部分的蛋白裂解反应；3D为RNA聚合酶，在病毒RNA复制时主导转录及复制反应；2B、2C、3A、3B等四种蛋白则与病毒RNA的复制有关。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VP1是EV71病毒的主要中和决定因子，因此VP1蛋白被认为是最适合来建立ELISA方法的抗原。

肠道病毒EV71的临床诊断主要依据三个方面：一是临床表现，二是血清学证据，三是病原学证据。由于肠道病毒EV71型感染临床表现多，因此肠道病毒EV71的血清学检测和病原学检测是目前最主要的依据。EV71感染产生终生免疫保护，感染后可检出IgM和IgG抗体。IgM试剂是最适于临床近期感染诊断的重要指标。EV71-IgM抗体酶联免疫检测试剂盒，是一种科学、方便、经济的EV-71感染的血清学检测方法。

肠道病毒71型抗体(IgM)的检测已有相关文献报道，基本上是以肠道病毒71型的病毒培养物为抗原作为包被抗原的间接ELISA，试剂盒在特异性、灵敏度和稳定性方面尚存诸多不足之处；并且，由于病毒培养成本高，效率低，无法大量供应市场。

发明内容：

本发明要解决的技术问题在于克服上述不足，提供一种临床检验急需、操作简便、适合各医疗疾控部门使用的可检测人血清或血浆中肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒及其制备方法和应用。

本发明提供了一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒，其组分包括：抗人-IgM(μ链)单克隆抗体预包被的微孔板、辣根过氧化物酶标记的重组肠道病毒71型抗原、阳性对照、阴性对照、标本稀释液、浓缩洗涤液(20×)、底物液A、底物液B和终止液。

本发明的技术方案是：首先将血清样本加入到微孔板中，样本中的IgM抗体被预包被在微孔板上的抗人-IgM(μ链)单克隆抗体吸附(捕获)，未结合的其他成分(包括特异的IgG抗体)将被洗涤除去，第二步，加入肠道病毒71型抗原酶标记物，被捕获的IgM中的EV71-IgM会与蜡根过氧化物酶标记的EV71重组抗原特异性的结合，洗去其他未结合物，辣根过氧化物酶会和后续加入的底物反应。最终达到检测EV71-IgM抗体的目的。

本发明的另一个目的是提供了一种肠道病毒71型抗体(IgM)的酶联免疫测定试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤：

1.抗人-IgM(μ链)单克隆抗体预包被微孔板的制备

1.1包被

0.05mol/L(0.05毫摩尔/升)，pH9.6碳酸钠-碳酸氢钠缓冲系统，加入适量抗人-IgM(u链)单克隆抗体，混匀后按每孔100ul(微升)加入到微孔板中，37℃放置2小时，室温过夜，然后甩去孔内液体，拍干；

1.2洗涤

0.01mol/L PBS-T(0.01毫摩尔/升磷酸氢钠-磷酸二氢钠缓冲系统，0.05％的Tween-20)，pH7.2，按每孔加入150ul的量加入到微孔板中，然后甩去，重复洗涤一次，拍干。

1.3封闭

0.01mol/L PBS，10％小牛血清，0.25％酪蛋白，0.1％硫柳汞钠，pH7.2，按每孔加入110ul的量加入到微孔板中，37℃放置2小时，然后甩去孔内液体，拍干；

1.4干燥