[发明专利]大肠杆菌S-甲酰谷胱甘肽水解酶的原核表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.FGH的原核表达载体pET32a-FGH，含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点RBS和FGH基因及一个组氨酸标签。

2.如权利要求1所述的原核表达载体，其中所述的S-甲酰谷胱甘肽水解酶基因FGH来源于大肠杆菌，其GenBank登录号为CP000802。

3.如权利要求1所述的原核表达载体，FGH基因的上游有T7启动子和细菌核糖体结合位点RBS，T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列，紧靠FGH基因的起始密码子上游还有一个组氨酸标签序列。

4.权利要求1的原核表达载体，由下述方法构建而得：

(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对特异引物：

FGH5：5’-CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3’

FGH3：5’-CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’

5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序列，形成Xho I酶切位点。以Escherichia coli的基因组为模版扩增，得到FGH的全长DNA序列；

(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH；

(3)构建原核载体pET32a-FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD-FGH和pET32a，并回收纯化FGH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得原核表达载体pET32a-FGH。

5.权利要求1的原核表达载体的构建方法，包括下述步骤：

(1)从GenBank中查找大肠杆菌FGH的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：

FGH5：5’-CCATGGAACTCATTGAAAAACATG-3’

FGH3：5’-CTCGAGTCAACGCATATTCAGTTTATTG-3’

5’端引物有CCATG特征序列，并由此形成Nco I酶切位点；3’端加CTCGAG特征序列，形成Xho I酶切位点。以Escherichia coli的基因组模版扩增，得到FGH的全长DNA序列；

(2)回收并纯化FGH全长基因片段，并将其连接到pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过酶切检测获得重组质粒pMD-FGH；

(3)构建原核载体pET32a-FGH，用NcoI和XhoI双酶切pMD-FGH和pET32a，并回收纯化FGH基因片段以及载体片段pET32a，然后连接、转化、抽提质粒进行单、双酶切检测，获得原核表达载体pET32a-FGH。

6.权利要求1的原核表达载体在制备FGH包涵体蛋白中的应用。

7.权利要求1的原核表达载体在制备FGH特异性抗体的抗原中的应用。

8.应用权利要求1-4所述原核表达载体制备FGH特异性抗体抗原的方法，将上述载体用热刺激法导入大肠杆菌蛋白表达专用受体菌株BL21中，获得转化子菌落，用1mM IPTG于37℃诱导4小时后获FGH重组蛋白，60％重组蛋白形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FGH蛋白，再从凝胶中回收FGH蛋白可得到纯度极高的FGH重组蛋白，可作为抗原用于FGH特异性抗体的制备。